抗鸭瘟病毒单克隆抗体的研制及标准抗原、标准抗体的制备

发布时间：2019-10-14 11:16

【摘要】：鸭病毒性肠炎(DVE,Duck viral enteritis),也称为鸭瘟(Duck plague),是由鸭肠炎病毒(DEV,Duck Enteritis Virus)引发的会致使鸭、鹅和多种雁形目禽类的急性、败血性、传染性的一种致命疾病。该病在我国属于三类疫病,是当前威胁养鸭业进步的重要疫病之一,其特点主要为传播迅速、发病率以及死亡率高、流行广泛。本研究制备3株针对鸭瘟病毒全病毒的单克隆抗体,初步建立抗原检测方法。同时对DEV VAC株种毒扩增并针对其制备鸭多抗血清,通过对所制备的抗原抗体的一系列标定后,获取DEV的标准抗原和标准血清。1.抗鸭瘟病毒单克隆抗体的制备及间接免疫荧光检测方法建立本研究将DEV VAC株通过SPF鸭胚扩增并对其进行纯化,将其作为免疫原免疫BABL/c小鼠进行单克隆抗体的制备,采用优化后的间接免疫荧光检测办法,对杂交瘤细胞进行两次筛选和四次亚克隆后,获得三株能够分泌DEV特异性抗体的杂交瘤细胞,分别命名为DEV-5H10、DEV-4H11、DEV-6D8,经亚类鉴定后判定DEV-5H10和DEV-6D8为IgG2b型单克隆抗体,DEV-4H11为IgM抗体,经Western-blot分析后,DEV-5H10和DEV-6D8能够与DEV VAC株反应出现69KDa大小的特异性条带,其腹水效价分别为1:1600以及1:3200。以单克隆抗体DEV-6D8为一抗,FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗,一抗、二抗孵育时间均为30min建立间接免疫荧光方法以检测病毒抗原,该方法最低可检测到1-10个TCID50感染的细胞病毒,对临床鸭瘟病毒的诊断具有重要意义。2.鸭瘟病毒标准抗原的制备本研究通过SPF鸭胚对DEV VAC株种毒进行扩增,并对所收集的病毒液进行病毒含量的测定,结果显示该病毒液TCID50=10-4.8/0.1mL,通过Western-blot鉴定、中和试验、血凝试验、PCR特异性分析进一步鉴定,表明该病毒液中无DHV(鸭病毒性肝炎)、GPV(小鹅瘟)、EDS(产蛋下降综合征)、IBDV(传染性法氏囊病)、REV(网状内皮组织增生)、REOV(呼肠孤病毒)、新城疫病毒(NDV)、禽流感(AIV)等外源病毒污染。通过无菌检验以及支原体检测,证明该病毒液未被细菌、支原体污染。在经一系列标定后的DEV全病毒抗原中添加1%BSA冻存保护剂,对其分装、冻干,再经物理性状检查、CV值测算、均一性、稳定性、保质期等检验后获得DEV标准抗原。对禽类生物制品质量控制和效力评估具有重要的意义。3.鸭瘟病毒标准血清的制备使用DEV VAC株病毒对SPF鸭进行免疫,制备DEV多抗血清,采用本实验所建立的间接免疫荧光抗体检测办法检测其IFA效价为1:27,对其进行微量细胞中和试验,测算其中和效价为1:58。利用间接免疫荧光实验以及血凝抑制试验鉴定该多抗血清的特异性及纯异性,证明该血清只与DEV反应而与GPV(小鹅瘟)、EDS(产蛋下降综合征)、IBDV(传染性法氏囊病)、REV(网状内皮组织增生)等病毒没有交叉反应现象,通过无菌检验以及支原体检测,证明该血清未被细菌、支原体污染。在经一系列标定后的鸭多抗血清中添加万分之一的硫柳汞防腐剂,进行分装以及冻干,再经物理性状检查、CV值测算、均一性检测、稳定性测试、保质期检测等检验后得到DEV标准血清。对禽类生物制品质量控制和效力评估具有重要的意义。
【图文】：

后出现鸭瘟病毒所有的特征病变在自然或实验感染后，几种水禽（绿头鸭逡逑Ｍａｌｌａｒｄｓ，美国黑鸭邋Ａｍｅｒｉｃａｎ邋Ｂｌａｃｋ邋Ｄｕｃｋｓ，北方针尾鸭邋Ｎｏｒｔｈｅｒｎ邋Ｐｉｎｔａｉｌ）的舌下逡逑唾液腺孔附近可发现口腔糜烂（图１．Ａ）。发病绿头鸭的食管出现局灶性出血．及逡逑坏死［２５］，表面覆盖有坏死上皮细胞构成的黄色假膜（图１．Ｂ）。食管腺胃交界处、逡逑大肠粘膜表面（图１．Ｃ），以及肠道环状带可能会出现出血和坏死。成年雌鸭可逡逑能在卵巢中出现广泛性出血以及体腔出血。通常出血和坏死部位为泄殖腔，肝脏逡逑和心脏（图１．Ｄ，，图１．Ｅ）。其他野生水禽物种上的病理变化有很多不同之处。逡逑最常见的病变一般有食道中的坏死性病变，环状带出血及坏死。心外膜、肝、脾、逡逑胰腺表面的点状出血和局灶性坏死［２６］。在不同物种上病理变化表现有所不同，例逡逑如曾报道自然感染鸭瘟病毒的木鸭环状带有出血现象，但是这些病变没有出现在逡逑实验感染的禽类体内。相反

结与讨论逡逑小结逡逑本研究将ＤＥＶ邋ＶＡＣ株通过绒毛尿囊膜途径接种ＳＰＦ鸭胚以扩增，死胚体全身弥散性出血，肝脏有局灶性坏死，绒毛尿囊膜严重水肿增厚，，尿囊液减少等典型的鸭瘟病理变化对发病死亡鸭胚的绒毛尿囊破碎，其后使用梯度离心和蔗糖垫底超速离心的方式进行病毒纯化，镜对纯化的病毒进行观察，可观察到清晰完整的病毒颗粒，直径约］７膜，可见明显的囊膜、外膜、六角形衣壳以及核心具有典型的形态。逡逑将此纯化的病毒作为免疫原接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠进行单克隆抗体的制备，检测其血清的ＩＦＡ效价，选取效价最高的小鼠在融合前７２－９６ｈ加强免
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.4

【参考文献】

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本文编号：2549234