E3泛素连接酶Nrdp1和SOCS-1对布鲁氏菌胞内生存以及布鲁氏菌所引起的细胞凋亡的影响

发布时间：2019-10-15 20:15

【摘要】：布鲁氏菌(Brucella)是一种强致病性人兽共染致病菌。布鲁氏菌侵染的主要目标是专业和非专业的巨噬细胞,于其内生存和繁殖。致病菌与宿主之间互作的分子机制错综复杂,也是布鲁氏菌病的病因。因此,对布鲁氏菌的胞内生存以及与宿主之间的分子互作机制的研究是有重要意义的。以泛素为主导的泛素-蛋白酶途径参与了胞内多种生理生化反应的调节,本研究对小鼠E3泛素连接酶Nrdp1和SOCS-1在布鲁氏菌侵染中的影响作了初步探讨。目的:本实验以布鲁氏菌宿主细胞小鼠巨噬细胞E3泛素连接酶Nrdp1和SOCS-1基因为研究对象,分别构建干扰和过表达Nrdp1和SOCS-1基因的小鼠巨噬细胞转染模型;羊种布鲁氏菌16M侵染小鼠巨噬细胞,探究其对布鲁氏菌胞内生存和布鲁氏菌诱导的巨噬细胞凋亡的影响。方法:(1)羊种布鲁氏菌16M侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,实时荧光定量PCR检测在侵染发生0h、2h、4h、8h、12h和24h时Nrdp1和SOCS-1基因相对表达量的变化。(2)在小鼠巨噬细胞RAW264.7中,构建两个基因的干扰模型PLL3.7-Nrdp1、PLL3.7-SOCS-1和过表达模型Plex-Nrdp1、Plex-SOCS-1。羊种布鲁氏菌16M侵染干扰和过表达Nrdp1和SOCS-1基因的小鼠巨噬细胞,分别进行CFU计数,细胞凋亡率流式细胞仪分析,以及实时荧光定量PCR检测凋亡相关因子Bax和Bcl-2、肿瘤坏死因子TNF-α的相对表达量变化。(3)羊种布鲁氏菌16M侵染巨噬细胞模型,在侵染发生的不同时间对JAK1、JAK2、JAK3、STAT1、STAT2、STAT3六个基因的转录水平进行实时荧光定量PCR检测,观察其表达量变化。结果:(1)随着侵染时间的变化,Nrdp1和SOCS-1的表达都分别出现了两次有规律的变化。布鲁氏菌进入细胞之后,这两个基因的表达量迅速上升,两小时后增加停止,开始下降;4h后达到最低,而后上升;8h时上升停止,开始下降,一直到24h时,都是表达下调的。2h和8h左右时,表达量是超出正常水平的。每个基因在不同侵染时间的各组中差异性显著(P0.05)。(2)分别构建Nrdp1和SOCS-1基因的两个干扰模型PLL3.7-N1、PLL3.7-N2和PLL3.7-S1、PLL3.7-S2,干扰效果分别为:66%、25%和54%、8%,选取干扰效果最好的PLL3.7-N1和PLL3.7-S1干扰模型进行侵染实验;过表达模型Plex-Nrdp1和Plex-SOCS-1两个基因的表达量分别升高了228%和332%。CFU实验显示,Plex-SOCS-1和Plex-Nrdp1组log CFU值显著低于对照组,PLL3.7-S1和PLL3.7-N1组差异不显著,各组实验的log CFU值随侵染时间都是升高的。Plex-SOCS-1组Bax和Bcl-2表达量显著升高,Bax/Bcl-2比值差异不显著;PLL3.7-S1组Bax表达量显著降低,Bcl-2表达量差异不显著,Bax/Bcl-2比值差异显著降低;Plex-Nrdp1组Bax和Bcl-2表达量显著升高,Bax/Bcl-2比值差异显著升高;PLL3.7-N1组Bax表达量显著降低,Bcl-2表达量差异不显著,Bax/Bcl-2比值差异显著降低;各组实验的Bax和Bcl-2表达量都是先升高(2-8h)后降低(8-24h)的趋势,Bax/Bcl-2比值都是先降低(2-8h)后升高(8-24h)的趋势。Plex-SOCS-1组TNF-α表达量显著升高,PLL3.7-S1组显著降低;Plex-Nrdp1与PLL3.7-N1两组的TNF-α表达量与对照组相比差异不显著;每组实验中,TNF-α的表达量随侵染时间都是升高的。细胞凋亡率流式细胞仪检测结果显示,Plex-SOCS-1组细胞凋亡率与对照组相比显著升高,PLL3.7-S1组细胞凋亡率与对照组相比显著降低;Plex-Nrdp1组细胞凋亡率与对照组相比显著升高,PLL3.7-N1组差异不显著;随着的侵染时间的变化,每组细胞凋亡率都是升高的。(3)Plex-SOCS-1组细胞的JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT3表达量与对照组相比显著降低,JAK3表达量差异不显著;PLL3.7-S1组细胞的JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT3表达量与对照组相比显著升高,JAK3表达量差异不显著;Plex-Nrdp1组细胞的JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT3表达量与对照组相比显著降低,JAK3表达量差异不显著;PLL3.7-N1组细胞JAK1、JAK2、JAK3、STAT1、STAT2、STAT3六个基因的表达量与对照组相比均差异不显著。结果表明,(1)在布鲁氏菌侵染过程中,小鼠基因Nrdp1和SOCS-1对布鲁氏菌的胞内生存有一定的抑制作用;(2)在布鲁氏菌侵染过程中,Nrdp1和SOCS-1诱导了细胞凋亡;(3)在布鲁氏菌侵染过程中,Nrdp1和SOCS-1基因对JAK/STAT信号通路有负向调控作用。综上所述,小鼠E3泛素连接酶Nrdp1和SOCS-1在布鲁氏菌侵染过程中对于布鲁氏菌胞内生存以及布鲁氏菌诱导的细胞凋亡有重要作用。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.12

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