硒对金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤和细胞凋亡的影响研究

发布时间：2019-10-18 18:57

【摘要】：奶牛乳腺炎是产后重要的常见疾病之一,其主要以病原菌入侵乳腺组织,并通过宿主逃逸机制在乳腺组织生存下来,从而进一步出现免疫细胞在乳腺内聚积、活性氧自由基(ROS)蓄积和炎性因子释放等病理学特征。该疾病每年对奶牛养殖业发展造成巨大的经济损失。硒(Se)是动物机体所必须的微量元素,其主要以硒蛋白的形式存在于机体内,发挥着抗氧化、抗炎、免疫调节和参与新陈代谢的生理功能。本实验室的前期研究发现硒可以提高哺乳期大鼠的免疫能力,提高抗氧化酶活性,抑制炎症反应,减轻炎症反应对机体造成的损伤。因此,本实验通过体外研究硒的抗氧化作用以及硒对凋亡相关通路蛋白的影响,为防治乳腺炎提供理论依据。实验用金黄色葡萄球菌按照MOI=1:1的比例接种奶牛乳腺上皮细胞(BMECs),作用0、1、2、4、6、8、10、12和24h,用CCK8法检测金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞活力的影响,用LDH检测试剂盒观察金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞造成的损伤作用,用流式细胞术观察金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞ROS水平的影响。结果显示:接种金黄色葡萄球菌后,随着时间的推移,奶牛乳腺上皮细胞活力显著下降,感染6、8和1 0h后,活力仅为80%、78.3%和77.3%;但LDH的活性逐渐提高,并在6h后极显著增加(p0.01或p0.001);流式细胞术检测结果显示,从4h开始,奶牛乳腺上皮细胞内ROS水平显著提高(p0.05),当侵袭8h时,ROS水平达到峰值,8h以后ROS水平显著下降(p0.05)。所以,采用MOI=1:1的比例接种金黄色葡萄球菌侵袭奶牛乳腺上皮细胞6、8、10h造成了细胞的氧化损伤,确定了氧化损伤模型的处理时间。为研究硒在细胞抗氧化反应过程中对相关氧化因子的影响,在培养基中添加不同浓度的硒(2、4和8μM),检测硒对金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞SOD、CAT、GSH-Px、COX-2和iNOS mRNA的表达影响,T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性的影响和MDA含量影响。结果显示,与对照组相比,金黄色葡萄球菌感染乳腺上皮细胞后,SOD、CAT和GSH-Px的mRNA表达均无显著变化。与金黄色葡萄球菌感染组,感染6h后,4、8μM的硒能显著或极显著的上调SOD的mRNA表达(p0.05或p0.001),2、4μM的硒能显著或极显著的上调CAT和GSH-Px的mRNA表达(p0.05或p0.001);感染8h后,8μM的硒能极显著的上调SOD和CAT的mRNA表达,2、8μM的硒能极显著的上调GSH-Px的mRNA表达(p0.01或p0.001)。在感染后6、8和10h,与对照组相比,金黄色葡萄球菌极显著提高COX-2和iNOS的mRNA表达(p0.001)。金黄色葡萄球菌感染感染6h后,硒能极显著抑制这一反应(p0.001);感染8h后,4μM的硒能极显著抑制COX-2的mRNA表达(p0.001),硒能极显著抑制iNOS的mRNA表达(p0.001);感染10h后,2、8μM的硒能极显著下调COX-2的mRNA表达(p0.001),4、8μM的硒能极显著抑制iNOS mRNA表达(p0.001)。在感染后6、8和10h,与对照组相比,金黄色葡萄球菌显著或极显著抑制了 T-AOC、T-SOD、CAT 的活性(p0.05 或p0.01),极显著增加 MDA 的含量(p0.001)。而与金黄色葡萄球菌感染组,硒能极显著提高T-AOC、T-SOD、CAT和GSH-Px的活性(p0.01 或p0.001),极显著减少 MDA 的含量(p0.001)。金黄色葡萄球菌除了能造成氧化损伤,产生炎症反应,还可导致凋亡相关因子诱导细胞死亡,从而造成组织结构不完整形成损伤。TLR2受体在金黄色葡萄球菌感染后除可调节炎症信号通路外,还可对凋亡相关蛋白进行调节。为从蛋白水平揭示硒对凋亡信号通路的影响,采用Western Blot技术对PI3K/AKT/Bcl-2信号通路中关键蛋白的表达进行检测。奶牛乳腺上皮细胞分5组,以不添加硒和金黄色葡萄球菌的细胞作为对照组,以金黄色葡萄球菌刺激0.5h的细胞作为金黄色葡萄球菌感染组,以不同浓度的硒(2、4和8μM)预孵育12h并用金黄色葡萄球菌刺激0.5h的细胞作为实验组,分别检测TLR2、AKT、P-AKT、Bcl-2、Bax和cleavedCaspase-3的蛋白表达。实验结果显示,金黄色葡萄球菌刺激乳腺上皮细胞0.5h后,与对照组相比,显著或极显著提高TLR2的蛋白水平和AKT的磷酸化水平(p0.05 或p0.001),极显著提高了 Bax/Bcl-2 的比值(p0.001),极显著增加了 Caspase-3的裂解(p0.001),启动了凋亡程序;与金黄色葡萄球菌感染组相比,8μM的硒能显著降低TLR2的蛋白水平(p0.05),同时8μM的硒能极显著提高AKT的磷酸化水平(p0.01),2、4和8μM的硒能极显著降低Bax/Bcl-2的比值(p0.001),进而极显著的抑制Caspase-3裂解启动细胞死亡程序(p0.001),很好地保护了细胞。综上所述,硒可以通过提高机体内抗氧化酶的水平和抑制细胞凋亡程序来发挥抗氧化、保护细胞和抑菌的作用。同时为奶牛乳腺炎的预防提供了基础理论数据和新方向。希望本研究结果为硒在兽医临床应用及金黄色葡萄球菌性奶牛乳腺炎的防治药物的开发提供理论指导及帮助。
【图文】：

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图１－１金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞活力的影响逡逑母相同表示差异不显著（ｐ〉０．０５），字母相邻表示差异显著（＾＜0．Ｆｉｇ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邋ｏｎ邋ｃｅｌｌ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋ｉｎ邋ＢＭＥＣｓ逡逑ｌｅｔｔｅｒｓ邋ｍｅａｎ邋ｎｏ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋（／？＞０．０５），邋Ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｔｔｅｒｓ邋

乳腺上皮细胞,字母,金黄色葡萄球菌,示差

２８逦扬州大学硕士学位论文逡逑图１－２金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞内ＬＤＨ的影响逡逑注：表示与Ｏｈ组相比差异极显著0？＜０．０１），“＊＊＊”表示与对照组相比（ｐ＜０．００１）。逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邋ｏｎ邋ＬＤＨ邋ｉｎ邋ＢＭＥＣｓ逡逑Ｎｏｔｅ：逦ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｏｈ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑３．３金葡菌对奶牛乳腺上皮细胞的ＲＯＳ水平的影响逡逑按ＭＯＩ＝ｌ邋：邋１的比例接种金黄色葡萄球菌，分别于０、１、２、４、６、８、１０、和１２ｈ后，逡逑采用流式细胞术测定金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞内ＲＯＳ水平。结果如图１－３所示，逡逑当金黄色葡萄球菌侵袭ＢＭＥＣｓ时，０？２ｈ内，ＲＯＳ水平与对照组相比差异不显著0？＞０．０５），逡逑从４ｈ开始，ＲＯＳ水平升高，，差异显著0？＜０．０５），当侵袭时间达到８ｈ时，ＲＯＳ水平达到峰逡逑值，８ｈ以后ＲＯＳ水平下降，差异显著（ｐ＜０．０５）。逡逑１０－．逡逑３－逦｜逡逑Ｓ逦６－逦Ｉ逡逑运逦＾逦ｂ逡逑Ｏ逦４－逦＋‘谷翕。逡逑＿１■攀乻邋Ｍ■‘逡逑０逦１逦２逦４逦６逦８逦１０逦１２逦２４逡逑时间（ｈ）逡逑图１－３金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞内ＲＯＳ水平的影响逡逑注：字母相同表示差异不显著（／７＞ａ0５），字母相邻表示差异显著（ｐ＜０．０５）。逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邋ｏｎ邋ＲＯＳ邋ｉｎ邋ＢＭＥＣｓ逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅ邋ｓａｍｅ邋ｌｅｔｔｅｒｓ邋ｍｅａｎ邋ｎｏ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋（ｐ＞０．０５）
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.23

【参考文献】