嵌合NDV-HA病毒样颗粒的制备与鉴定

发布时间：2019-10-24 09:34

【摘要】：新城疫和禽流感是严重危害养禽业的两大动物疫病,其中基因Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)仍是当前的主要优势流行株。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是由病毒结构蛋白装配而成的空心颗粒,不携带核酸,具有良好的安全性和免疫原性。本试验将AIV HA胞外域与NDV F基因胞内、跨膜域融合构建FcH9融合序列;进一步通过利用昆虫杆状病毒表达系统构建含有FcH9序列的重组杆状病毒rBV-FcH9,与实验室已构建rBV-M和rBV-HN共感染Sf9细胞,收集感染细胞上清,经蔗糖密度梯度离心法纯化嵌合VLPs。血凝血抑试验结果显示嵌合VLPs中HN和HA效价均为28;Western blot分析表明该VLPs可以与特异性阳性血清发生反应;透射电镜观察该VLPs具有典型的病毒粒子结构正,形态大小与野生型NDV相似。结果表明:本试验成功制备了包含有HN和HA蛋白的嵌合VLPs,为研制新型NDV-AIV二联疫苗候选株奠定基础,并为当前新城疫与H9N2亚型禽流感的防控提供策略。
【图文】：

重叠延伸,嵌合基因,片段,特异性引物

Ｈ９阳性血清各２５μＬ连续倍比稀释（对照组不加血清），之后每孔滴加２５μＬＶＬＰｓ在３７℃孵育４５ｍｉｎ。最后每孔滴加２５μＬ１％鸡红细胞，冰上孵育３０ｍｉｎ后判定血凝效价。２结果２．１目的基因的扩增与连接利用特异性引物，以ＦｃＤＮＡ和ＨＡｃＤＮＡ为模板，成功扩增出Ｆ基因的胞内域和跨膜域及ＨＡ的胞外域。扩增产物利用特异性引物经重叠延伸ＰＣＲ连接获得ＦｃＨ９片段（１７５５ｂｐ），片段大小与预期相符（图１）。图１ＦｃＨ９嵌合基因重叠延伸ＰＣＲ扩增Ｍ．ＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１～５．ＦｃＨ９片段２．２重组杆状病毒基因组的鉴定以Ｐ３代ｒＢＶ－ＦｃＨ９基因组为模板，分别用Ｍ１３引物和特异性引物进行ＰＣＲ扩增，，可见４０５０ｂｐ左右的条带和１２３９中国兽医学报２０１７年７月第３７卷第７期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＪｕｌ．２０１７Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．７

重组杆状病毒,蛋白,结构蛋白,阳性血清

１７５０ｂｐ左右的条带，与预期目的片段大小相符（图２Ａ，Ｂ）。图２重组杆状病毒ＰＣＲ鉴定Ｍ１．ＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ａ１～Ａ４．重组杆状病毒基因组Ｍ１３引物的ＰＣＲ产物；Ｍ２．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ｂ１、Ｂ２．特异性引物ＰＣＲ产物２．３Ｓｆ９细胞病变观察重组杆状病毒共感染后可见Ｓｆ９细胞变大，内部颗粒化，有碎片形成，并逐渐脱落（图３Ａ），图３Ｂ为未接毒Ｓｆ９细胞。图３Ｓｆ９细胞电镜观察Ａ．正常Ｓｆ９；Ｂ．病变Ｓｆ９２．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测与鉴定将纯化的ｃＶＬＰｓ进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测，使用Ｈ９阳性血清为一抗，结果可见在７５０００处出现目的条带（图４Ａ）；以ＮＤ阳性血清为一抗，结果可见与预期相符的条带，ＨＮ蛋白大小约为７００００，Ｍ蛋白约４００００（图４Ｂ）。图４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定图Ｍ．蛋白Ｍａｒｋｅｒ；Ａ１．结构蛋白ＦｃＨ９；Ｂ１．结构蛋白ＨＮ和Ｍ；Ｂ２．纯Ｍ蛋白ＶＬＰ对照１２４０中国兽医学报２０１７年７月第３７卷第７期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＪｕｌ．２０１７Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．７
【作者单位】：吉林大学动物医学学院/人兽共患病研究教育部重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金资助项目(31472195,31402195) 国家公益性行业(农业)科研专项资助项目(201303033)
【分类号】：S855.3

【参考文献】