抗菌肽P3类似物JH-3的筛选及抗菌作用研究

发布时间：2019-10-24 06:25

【摘要】：传统抗生素的滥用，临床上多种耐药菌株、超级细菌等的出现，对畜牧业的健康发展以及人类健康造成了极大的威胁。研制高效广谱抗菌、不易产生耐药性，且对机体低毒甚至无毒的新型抗菌药物，以替代传统抗生素，成为一项迫切的任务。在开发新型抗菌药物的过程中，，抗菌肽以其广谱的抗菌活性进入人们的视野，并逐渐成为研究的热点。抗菌肽是生物体在抵抗外来微生物入侵时产生的一类防御性小肽，是机体先天免疫系统的重要组成部分。与传统的抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、水溶性好、热稳定性好，抗菌机理独特，对临床耐药细菌具有广谱的抗菌活性，且不易诱发细菌产生耐药性等特点。随着研究的进一步深入，人们还发现抗菌肽不仅具有良好的抗菌活性，还表现出良好的抗病毒、抗真菌、选择性抑制肿瘤细胞生长等生物活性，并且对动物体的免疫功能具有一定的调节作用。 本研究中，以本课题组由牛红细胞血红蛋白α亚基中分离到的抗菌肽P3为研究对象。通过对其进行氨基酸序列分析、分子设计等，以提高其杀菌活性，并对其溶血性、细胞毒性、特异性选择抑制Hela细胞活性进行分析。通过CD扫描，对P3进行结构分析；采用膜渗透性、扫描电镜观察、膜电位检测等试验，对P3的膜破坏机制进行初步的探索。分析P3进入细胞后对细胞内液中钙离子浓度平衡的干扰作用。结合P3的膜-肽作用机制，以阐明P3的杀菌机制。并通过构建ICR小鼠感染模型，对P3及其类似物在小鼠体内的抗感染活性进行研究。 为了增强P3的抑菌活性，通过结构优化设计了四条P3类似物序列，分别命名为JH-0、JH-1、JH-2、JH-3。与P3相比，四种类似物对五种测试菌株的MIC值均有不同程度的升高，且溶血性、细胞毒性较小，其中JH-3对癌细胞Hela表现出良好的选择性抑制活性。膜-肽作用机制分析发现：P3在细菌磷脂膜模拟环境下，自身形成α-螺旋结构；P3作用于细菌后，导致细菌细胞膜的通透性增加，并在细胞膜表面形成孔洞样结构、区域性裂解，对细胞膜的生理结构形成物理性损伤，并造成细胞生理性膜电位的去极化。同时P3进入细胞内，引起胞浆内的钙震荡，造成钙超载。P3通过对细胞膜以及细胞内多样化的作用方式最终导致细菌死亡。 ICR小鼠体内毒性试验发现：P3及其类似物在小鼠体内的LD50均高于临床常用药物PMB，而且小鼠对腹腔注射时抗菌肽的吸收率优于皮下注射。P3及其类似物对临床耐药菌感染ICR小鼠的保护率均大于60%，其中JH-3对感染小鼠的保护率高达90%，而Amp组和空白组的小鼠在20h内全部死亡。并且在注射后2h，P3及其类似物可有效降低小鼠血液中的菌落含量，以JH-3组差异极其显著。该研究表明：P3及其类似物对耐药菌感染小鼠表现出良好的抗感染能力。
【图文】：

第一章 文献综述成分子内二硫键，使其二级结构呈现 β-折叠结构。这类抗菌肽主要包括植物虫、哺乳动物类的防御素以及富含脯氨酸的抗菌肽。（3）线性结构抗菌肽，如图 1-1（C）。这类抗菌肽缺少二级结构，一级中多含有某一种或几种氨基酸，如牛嗜中性粒细胞抗菌肽 Indolicidin，由 1氨基酸组成，其中含有 5 个色氨酸。

图2-2 P3和JH-3对E. coli ATCC 25922 (A), an E. coli clinical strain (B), C. albicans ATCC90029(C), and C. albicans clinical strain(D) (6×105CFU/mL)在2×MIC浓度下作用不同时间的实时杀菌动力学Figure 2-2 Bacterial survival after treatment with peptides. The killing kinetics of P3 and JH-3. E.coli ATCC 25922 (A), an E. coli clinical strain (B), C. albicans ATCC90029 (C), and C. albicans(D) (6×105CFU/mL) were exposed to P3 and JH-3 at 2×MIC for 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, and 60min.3.3 对正常体细胞的细胞毒性许多研究发现，部分天然抗菌肽在发挥抑菌活性的同时，对正常的体细胞并不具有细胞毒性[54]。虽然目前关于抗菌肽作用机制尚不明确，但是高效抗菌，并对正常体细胞低毒、无毒的特性，必然会是抗菌肽在未来得到进一步开发、应用的一独特优势。本研究选取红细胞、HaCaT 两种细胞为代表，以分析 P3 及其类似物对哺乳动物正常体细胞的细胞毒性，为 P3 及其类似物的后续研究、开发提供科学的依据。3.3.1 溶血性
【学位授予单位】：河南科技学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S859.79

【共引文献】

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4 陈

本文编号：2552428