表达新城疫病毒HN蛋白重组鸭肠炎病毒的构建

发布时间：2019-10-24 00:47

【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、高度接触传染性呼吸道疫病,是禽类疫病中危害最为严重的烈性传染性疫病之一,目前我国新城疫病毒流行的主要毒株是基因Ⅶ型新城疫病毒。该病毒主要保护性抗原为病毒表面的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白和融合(F)蛋白。其中,HN蛋白是主要的宿主保护性蛋白和病毒的毒力蛋白,能侵染细胞并能够诱导机体产生中和抗体,兼具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种活性。鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis,DVE)是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的一种的急性、热性和败血性传染疫病。该病毒基因组较大可容纳多个外源基因的插入且感染宿主范围较窄,只感染鸭、鹅等雁形目禽类而不感染鸡。另外,该病毒可以产生快速免疫保护,具有作为疫苗活载体的优势。目前,对于新城疫和鸭病毒性肠炎这两种疫病的防控主要依赖疫苗接种,包括弱毒疫苗和灭活疫苗。弱毒疫苗激发机体产生抗体应答快速,但容易受母源抗体的干扰;灭活疫苗能够产生持久的免疫保护,但是刺激机体产生抗体较慢。因此有必要研制新型基因工程疫苗以弥补上述两种疫苗的不足。经本课题组前期研究证明:TK基因和US10基因都是病毒的复制非必需基因,缺失后不影响病毒的复制,因此可以作为外源基因的插入位点。不仅如此,TK基因是病毒的主要毒力基因,缺失后病毒的毒力降低但免疫原性不变,该基因已逐渐成为构建新型基因缺失疫苗的首选靶基因。故本研究选择鸭肠炎病毒TK基因作为外源基因的插入位点,以实验室已构建的r DEV TK-EGFP为亲本病毒,采用同源重组技术构建表达新城疫病毒HN蛋白的重组鸭肠炎病毒r DEV TK-HN,并对其进行基因水平、蛋白水平的鉴定。利用新城疫病毒HN基因特异性引物PCR检测到大小约为1.7 kb的HN基因插入,Western blot检测到大小为74 k D的新城疫病毒HN蛋白的表达,间接免疫荧光检测在绿色荧光视野下可见带绿色荧光的蚀斑,这些都表明HN基因已经准确插入到重组病毒TK基因位置并可以稳定表达。对该重组病毒的复制动力学检测表明与亲本病毒相比,该重组病毒的毒力略有下降,但是总体趋势仍保持一致。该重组病毒经鸡胚成纤维细胞(CEF)和SPF鸡胚分别连续传代20代后,每五代进行基因和蛋白水平的检测,PCR都可以检测到约为1.7 kb的NDV HN基因插入,Western blot都可以检测到74 k D的NDV HN蛋白的表达,间接免疫荧光检测在绿色荧光视野下都可见带绿色荧光的蚀斑,这些证实了HN基因可以随病毒复制而稳定遗传并表达,说明该重组病毒具有良好的遗传稳定性。在成功构建重组鸭肠炎病毒r DEV TK-HN的基础上,以该重组病毒为亲本病毒,在US10基因位置插入EGFP报告基因构建TK基因和US10基因双缺失的重组鸭肠炎病毒r DEV TK-HN\US10-EGFP。经两代蚀斑纯化后PCR鉴定表明EGFP基因已插入到鸭肠炎病毒US10基因位置,但是该重组病毒不能稳定传代,表明TK基因和US10基因双缺失在一定程度上影响病毒的复制。该重组病毒没有纯化完全,仍需要设计更优化的实验方法进一步纯化该重组病毒。该重组病毒为构建TK基因和US10基因双缺失表达新城疫病毒主要保护性抗原HN蛋白和F蛋白的重组鸭肠炎病毒奠定基础,以期研制出高效的新城疫新型基因工程疫苗,对新城疫和鸭病毒性肠炎的防控具有重要意义。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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本文编号：2552311