CLDN4在PRRSV感染Marc-145细胞中的作用

发布时间：2019-10-28 23:29

【摘要】：由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)所引发的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),是一种主要表现为怀孕母猪的食欲不振、持续发热及流产、早产、产木乃伊胎和弱仔等繁殖性能障碍以及哺乳仔猪和育成猪的高度死亡率和呼吸系统疾病等特征的高度接触性传染病。由于对该PRRSV的致病机制、持续感染机制以及免疫机理尚不明确,导致该病疫苗的研发与使用困难重重,难以控制。而且一旦养殖场发生PRRS,净化猪群所花费的时间和费用亦会很大,所以猪繁殖与呼吸综合征至今仍是威胁各国猪养殖的重要疫病之一。Claudin-4(CLDN4)蛋白作为紧密连接蛋白家族中的主要成员之一,主要分布于脑、肾、肺、小肠和结肠的组织中。在多种病毒感染过程中起着重要作用。在发生急性肺损伤时,CLDN4会贯穿肺泡上皮并且其表达量亦会上升。而PRRSV对猪体的呼吸系统,尤其是肺脏亦会造成严重的损伤,我们前期的研究也发现PRRSV感染Marc-145细胞后会使CLDN4蛋白表达升高,本研究将进一步研究CLDN4在PRRSV感染过程中的作用。从RNA水平检测CLDN4对PRRSV感染的影响:PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间用荧光定量检测CLDN4的mRNA的表达水平,结果表明PRRSV感染Marc-145细胞后CLDN4的mRNA的表达水平在前期和中期变化不明显但是在病毒感染后期显著增加。为进一步研究CLDN4在PRRSV感染Marc-145细胞的作用,构建CLDN4真核表达载体并转染Marc-145细胞,使其在Marc-145细胞中过表达,荧光定量检测转染pEGFP-N1-CLDN4、转染pEGFP-N1空白质粒和未转染的Marc-145细胞对PRRSV感染力的影响。结果表明转染pEGFP-N1空质粒和转染pEGFP-N1-CLDN4重组质粒后,N蛋白的mRNA表达水平均下调,但是后者较前者N蛋白的m RNA表达水平要低17倍,显著差异。从蛋白水平检测CLDN4对PRRSV感染Marc-145细胞的影响:克隆CLDN4基因连接到原核表达载体中,进行CLDN4蛋白的表达纯化,纯化后的蛋白免疫小鼠制备了CLDN4的多抗和单克隆抗体。IFA和Western Blot实验证明了抗CLDN4的单克隆抗体能够与Marc-145细胞上的CLDN4结合。用荧光定量检测制备的多抗及单抗对PRRSV感染Marc-145细胞的作用,结果表明,血清和单抗均能增强PRRSV的感染能力。通过以上实验结果表明,PRRSV感染后能使CLDN4的表达量在感染后期明显升高,抗CLDN4的血清和抗体对PRRSV的复制有一定的增强作用。
【图文】：

猪繁殖与呼吸综合征病毒

图 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的分类地位Fig. 1 Demarcation of viruses and the station of PRRSV(Cavanagh, 1997)1.2.2 形态结构及理化性质PRRSV 为一种单股正链的 RNA 病毒，有囊膜，其纯化的病毒粒子在电子显呈现球形，直径约 45-80nm，有 25-35nm 的呈二十面体对称的立方形核心（核衣核衣壳具有电子致密性，表面有细小的突起，其外包被有一脂质双层膜(Benfiel殷震，，1997)（如图 2 所示）。

结构模式,核衣壳

图 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的分类地位Fig. 1 Demarcation of viruses and the station of PRRSV(Cavanagh, 1997)1.2.2 形态结构及理化性质PRRSV 为一种单股正链的 RNA 病毒，有囊膜，其纯化的病毒粒子在电子显微呈现球形，直径约 45-80nm，有 25-35nm 的呈二十面体对称的立方形核心（核衣壳核衣壳具有电子致密性，表面有细小的突起，其外包被有一脂质双层膜(Benfield,殷震，1997)（如图 2 所示）。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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