柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白的初步研究

发布时间：2019-11-12 23:43

【摘要】：鸡球虫病在世界范围内严重影响养鸡业的健康发展,给养鸡业造成巨大的经济损失,该病主要是由艾美耳属球虫寄生于鸡肠道引起。在7种艾美耳球虫中,柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是分布最广、致病力最强的球虫之一,它寄生在盲肠的黏膜下,引起出血性肠炎,可导致鸡死亡。鸡球虫属于顶复器门原虫,顶复器门原虫是一类专一性的细胞内寄生虫,这类寄生虫尽管入侵的宿主细胞各不相同,但它们都有一个共同保守的入侵机制,当虫体黏附宿主细胞后,在虫体顶端与宿主细胞膜表面形成一个紧密的运动接触环(Moving Junction,MJ),这一特殊结构在虫体入侵宿主细胞过程中发挥至关重要的作用。研究发现由微线体分泌的顶体膜抗原1(Apical membrance protein-1,AMA1)是组成MJ的关键分子,因此,与AMA1相互作用的分子可能参与形成MJ,并在虫体入侵宿主细胞过程中必不可少。为了弄清楚柔嫩艾美耳球虫AMA1的相互作用分子以及在虫体入侵过程中发挥的作用,本实验室前期利用酵母双杂交技术,以柔嫩艾美耳球虫顶体膜抗原1(Et AMA1)为诱饵,筛选了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交c DNA文库,获得一些可能与Et AMA1相互作用蛋白的ESTs序列。本研究选取其中编号为559和39的两个EST序列,对其进行克隆、表达和功能初步分析,并对其与Et AMA1的相互作用关系进行了验证。1.柔嫩艾美耳球虫CHP559和CHP39基因的克隆及生物信息学分析选取的两个EST序列均含有3’末端的Ploy(A)尾,利用5’RACE技术获得了这两个基因含完整开放阅读框的全长c DNA序列,编号559与39基因的ORF分别与柔嫩艾美耳球虫保守的假想蛋白(hypothetical protein,conserved)ETH_00024035与ETH_00029745有100%同源,因此,分别将2个基因命名为Et CHP559和Et CHP39。Et CHP559基因全长1 746 bp,ORF长1 224 bp,编码407个氨基酸,编码蛋白的分子量为46.04 k Da,有跨膜结构和信号肽,没有保守结构域,有15个抗原位点。Et CHP39基因全长1 344 bp,ORF长873 bp,编码290个氨基酸,预测分子量为32.6 k Da,无跨膜结构和信号肽,没有保守结构域,有9个抗原位点。经荧光定量PCR检测发现,Et CHP559基因在孢子化卵囊和子孢子发育阶段有转录,子孢子阶段的转录水平最高,表明Et CHP559是在子孢子阶段高效表达的基因。Et CHP39基因在4个发育阶段均有转录,但转录水平不同,其中在孢子化卵囊阶段转录水平最高,其次在未孢子化卵囊的转录水平高于子孢子和裂殖子,表明Et CHP39基因的转录水平受到虫体阶段性的调控。2.柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白Et CHP559和Et CHP39的原核表达及功能初步研究将Et CHP559基因克隆到原核表达载体p GEX-4T-2和p Cold-TF中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导成功表达了重组蛋白GST-Et CHP559和His-Et CHP559,其中重组蛋白GST-Et CHP559为包涵体表达,重组蛋白His-Et CHP559有可溶性表达。将Et CHP39基因克隆到原核表达载体p ET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导成功表达了重组蛋白His-Et CHP39,且以包涵体形式表达。分别利用Ni柱亲和层析和切胶纯化的方式获得了重组蛋白His-Et CHP559和His-Et CHP39,用纯化的蛋白免疫家兔获得多抗血清,经Western-blot分析表明重组蛋白Et CHP559和Et CHP39都具有良好的免疫原性和反应原性。采用间接免疫荧光定位技术对Et CHP559和Et CHP39蛋白在球虫不同发育阶段的分布和定位进行分析,结果显示,Et CHP559蛋白在未入侵前主要位于子孢子的表面,当准备入侵时该蛋白的表达量上升并趋向于顶端,在子孢子接入DF-1细胞2 h后,发现该蛋白主要位于虫体的顶端,子孢子入侵DF-1细胞24 h后,蛋白的表达增加,且逐渐往虫体的后端分泌;Et CHP39在未入侵前主要位于子孢子的顶端,当准备入侵时该蛋白分泌到子孢子的表面以及顶端,子孢子加入DF-1细胞2 h后,发现该蛋白主要位于虫体的顶端,入侵DF-1细胞24 h后,蛋白的表达增加,且逐渐往虫体的后端分泌,当虫体发育为裂殖子时,该蛋白也主要位于裂殖子的顶端。通过体外抑制实验检测不同浓度的多抗对子孢子入侵DF-1细胞的影响,结果显示,anti-r Et CHP559抗体作用子孢子后,与正常兔血清Ig G组相比子孢子入侵DF-1细胞的能力明显下降,且随着抗体浓度的不断增大,作用后子孢子入侵力逐渐降低,抗体抑制率逐渐升高,当抗体浓度为300μg/m L,抑制率高达70%;anti-r Et CHP39抗体作用子孢子后,与对照组相比子孢子入侵DF-1细胞的能力下降,且随着抗体浓度的不断增大,作用后子孢子入侵力逐渐降低,抗体抑制率逐渐升高,当抗体浓度为400μg/m L,抑制率为30%左右。3.柔嫩艾美耳球虫CHP559和CHP39蛋白与AMA1蛋白互作关系的验证利用真核表达的蛋白对Et CHP559和Et CHP39蛋白与Et AMA1蛋白的相互作用关系进行了验证。将Et CHP559和Et CHP39基因分别克隆至真核表达载体pc DNA3.1-flag和p Bi FC-VC155,同时将Et AMA1基因分别克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)和p Bi FC-VN155,所构建的真核重组表达质粒经PCR和双酶切鉴定正确后转染DF-1细胞进行表达,经Western-blot和间接免疫荧光鉴定所构建的真核重组表达质粒在DF-1细胞内成功表达。利用构建的pc DNA3.1-flag-Et CHP559、pc DNA3.1-flag-Et CHP39和pc DNA3.1-Et AMA1质粒进行免疫共沉淀实验,结果显示Flag单抗可以沉淀DF-1细胞中表达的Et CHP559和Et CHP39蛋白,却不能同时沉淀DF-1细胞中表达的Et AMA1蛋白;利用构建的p Bi FC-VC155-Et CHP559、p Bi FC-VC155-Et CHP39和p Bi FC-VN155-Et AMA1质粒转染DF-1细胞后进行双分子荧光互补实验,结果显示实验组和阴性对照组细胞均不能检测到明显荧光,阳性对照组细胞有明显绿色荧光。结果说明通过上述方法未能检测出Et CHP559和Et CHP39与Et AMA1存在相互作用。
【图文】：

蛋白,相互作用,共转染,细胞

图 4.10 BiFC 分析蛋白之间的相互作用lecular Fluorescence Complementation assay to analyze the prnVN173 和 pBiFC-bFosVC155 的 DF-1 细胞；B：共转染 pBiF DF-1 细胞；C：共转染 pBiFC-VC155-EtCHP39 和 pBiFC-VN1转染 pBiFC-bJunVN173 和 pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155 的 DFsfected with pBiFC-bJunVN173 和 pBiFC-bFosVC155; B: DF-1 ce 和 pBiFC-VN155-EtAMA1 ; C: DF-1 cells were co-transfected wi1; D: DF-1 cells were co-transfected with pBiFC-bJunVN173和pB用抗 rEtCHP559 和 rEtCHP39 的兔源多抗与抗 rEtA1 与 EtCHP39 和 EtAMA1 做了天然蛋白的免疫荧光共h 后，EtCHP559 蛋白和 EtAMA1 蛋白都同时定位在虫是同时定位在虫体顶端，这说明在子孢子入侵细胞过程双杂交实验的结果，，推测 EtCHP559 和 EtCHP39 蛋白系。

蛋白,相互作用,共转染,细胞

【参考文献】