貂源H9N2亚型流感病毒的分子生物学特性及其致病性研究

发布时间：2019-11-12 23:12

【摘要】：在2013年8月中旬,本实验室从山东省中东部地区45份有呼吸道症状水貂的肺组织中分离到两株H9N2亚型的流感病毒,A/mink/Shangdong/F6/2013(H9N2)(Mk/SD/F6/13)株和A/mink/Shangdong/F10/2013(H9N2)(Mk/SD/F10/13)株,并且在265份血清样本中,53份血清样本中抗H9N2亚型流感病毒抗体为阳性,阳性率达到20%。根据Genbank中H9N2亚型流感病毒的各个基因序列,分别设计扩各基因片段的特异性引物,采用RT-PCR方法扩增Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NS、M各段基因,并分别将扩增产物克隆入T载体中进行基因组测序并对序列进行了分析。同源性分析结果,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的八个基因片段的同源性为99.7%~100%;这两株病毒的HA,NP和NS基因与A/chicken/Zhejiang/329/2011(H9N2)毒株的相应片段同源性最高,分别为97.9%、98.7%、98.1%;NA和PB1基因与A/duck/Hunan/S4111/2011(H9N2)毒株的相应片段同源性最高,分别为98.2%、98.6%;PA和M基因与A/chicken/Shanghai/C1/2012(H9N2)毒株的相应片段同源性最高,分别为98.6%、99.4%;然而,PB2基因与A/Turkey/California/189/66(H9N2)毒株的PB2基因同源性最高,为97.2%。为了进一步分析两株H9N2亚型流感病毒的基因片段的起源,用GeneBank中的H9N2亚型流感病毒的序列作为参考序列,进行系统发生分析。HA基因系统发生分析结果,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13位于欧亚系的Y280亚系分支上,并且与A/chicken/Shanghai/C1/2012(H9N2)毒株具有最近的亲缘关系;在NA的进化树上,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13均位于欧亚系的Y280亚系分支上并且与A/duck/Hunan/S4111/2011(H9N2)具有最近的亲缘关系;“内部基因”PB1,PA,NP,M和NS的基因系统发生分析结果,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13均位于欧亚系的Shanghai/F/98亚系分支上且与A/chicken/Shanghai/C1/2012(H9N2)毒株具有最近的亲缘关系;PB2基因系统发生分析结果,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13位于北美系的A/Turkey/Wisconsin/1/66的分支上。为进一步揭示Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的分子特征,用DNASTAR软件分别推导Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13各基因片段的氨基酸序列,并与参考毒株进行比较分析。氨基酸序列分析结果,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的氨基酸序列同源性为100%;Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13 HA蛋白的第226位氨基酸均为亮氨酸(Leu),具有SAα-2,6-Gal的受体结合特性;在HA蛋白的裂解位点处氨基酸序列为RSSR,表明两株病毒均是低致病性的毒株;HA蛋白有8个潜在糖基化位点,与A/Chicken/Shanghai/F/98和A/Chicken/Beijing/1/94两参考株相比,Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13在218位氨基酸处丢失了一个潜在的糖基化位点,在313位氨基酸处增加了一个潜在的糖基化位点;Mk/SD/F6/13和Mk/SD/F10/13的PB2蛋白的627位氨基酸位点为Lys,说明该两毒株具有哺乳动物受体结合特性。为了解所分离毒株对水貂的致病性,用Mk/SD/F6/13毒株作为代表毒株,建立了H9N2亚型流感病毒对水貂致病性研究的实验动物模型,并对临床症状、剖检病理变化、排毒情况、组织病理学变化、病毒在组织器官的分布、血清抗体等各项指标进行了检测。在试验期间,感染水貂表现出轻微呼吸道症状;在1~4天的鼻咽拭子检测到H9N2亚型流感病毒;感染水貂肺脏组织表现出血性间质性肺炎、心脏组织表现心肌纤维间出血、脾脏组织出血组织病理学变化;从感染水貂的肺脏、心脏、气管、结肠中检测到H9N2亚型流感病毒;在感染水貂的血清中检测到抗H9N2亚型流感病毒抗体,效价为1:64-1:512;实验期间感染水貂没有出现死亡。结果表明Mk/SD/F6/13毒株确实能够感染水貂并且致病性较低。本研究第一次证实了水貂能够自然感染H9N2亚型流感病毒,这不仅可能会对水貂的养殖业造成危害,而且水貂也可能成为流感病毒的中间宿主而感染其他动物。尽管貂源H9N2亚型流感病毒对其他动物的感染能力尚不清楚,但本研究对做好H9N2亚型流感病毒的防制和监测工作提供了重要的分子流行病学资料,因而具有重要的公共卫生学意义。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.92

【参考文献】

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本文编号：2559991