三重荧光PCR检测食源性致病菌方法的建立与初步应用

发布时间：2019-11-15 01:02

【摘要】：根据大肠杆菌O157的rfbE基因、志贺肠杆菌ipaH基因、单增李斯特杆菌hlyA基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌的多重实时荧光PCR方法。试验结果显示,该方法对大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌进行3联扩增的相对灵敏度检测限分别为5×10~2、5×10~2和5×10~3CFU/mL;对10株标准/参考菌株的检测结果,只有目的菌株呈阳性反应;用该方法检测26份冻肉样品,与传统的细菌分离鉴定法结果一致,说明研究建立的方法是鉴定3种食源性致病菌的有效方法。
【图文】：

三重,荧光,大肠杆菌O157

卫生微生物学检验大肠埃希氏菌0157:H7/NM检验、GB4789．5－2012食品微生物学检验志贺氏菌检验、GB4789．30－2010食品微生物学检验单核细胞增生李斯特菌检验)进行验证。3结果与分析3．1三重荧光PCＲ方法的建立最终建立的反应体系为:2×TaqPCＲMasterMix12．5μL，上下游引物各0．5μL(10μmol/L)，探针各0．5μL(10μmol/L)，DNA模板为5μL，补水至25μL。反应程序:94℃3min;94℃15s，55℃40s(收集荧光信号)，40个循环。3．2特异性结果对抽提的10种细菌的基因组DNA，利用建立的荧光定量PCＲ体系进行检测，结果见图1。由图1可知，，建立的检测方法对大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌检测为阳性，其他7株菌株均为阴性，说明该方法具有较好的检测特异性。图1三重荧光PCＲ特异性扩增结果1:大肠杆菌O157扩增曲线;2:志贺肠杆菌扩增曲线;3:单增李斯特杆菌扩增曲线3．3敏感性结果所建立的三重荧光PCＲ方法对大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌进行单一扩增的相对灵敏度检测限分别为5×101、5×101和5×103CFU/mL，进行三联扩增的相对灵敏度检测限分别为5×102、5×102和5×103CFU/mL。具体结果见图2。图2大肠杆菌O157灵敏度扩增曲线(从左到右曲线依次5×107－5×101CFU/mL)87

扩增曲线,大肠杆菌O157,灵敏度,肠杆菌

Ｓ赏?可知，建立的检测方法对大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌检测为阳性，其他7株菌株均为阴性，说明该方法具有较好的检测特异性。图1三重荧光PCＲ特异性扩增结果1:大肠杆菌O157扩增曲线;2:志贺肠杆菌扩增曲线;3:单增李斯特杆菌扩增曲线3．3敏感性结果所建立的三重荧光PCＲ方法对大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌进行单一扩增的相对灵敏度检测限分别为5×101、5×101和5×103CFU/mL，进行三联扩增的相对灵敏度检测限分别为5×102、5×102和5×103CFU/mL。具体结果见图2。图2大肠杆菌O157灵敏度扩增曲线(从左到右曲线依次5×107－5×101CFU/mL)87

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