猪流行性腹泻病毒优势流行毒株筛选及表达S蛋白重组伪狂犬病毒的构建

发布时间：2019-11-15 06:17

【摘要】：猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是一种急性、高度接触性猪肠道传染病,临床上以仔猪腹泻、呕吐、脱水为主要特征。2010年下半年以来,PED在我国出现新的暴发流行,造成哺乳仔猪的大量死亡。现已成为严重危害我国养猪业发展的重要腹泻病之一。在我国现流行的PEDV大多数为基因2型,其中S基因存在碱基的插入和缺失,与基因1型标准株CV777的同源性仅有85%左右。而我国传统的PED疫苗毒株属于基因1型,对猪的免疫保护效果不佳。到目前为止还没有一种理想有效的疫苗来预防和控制养猪生产中PED的发生。另一方面,伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)的基因组很大,达150kb左右,具有宿主范围广,不感染人,含有多个可以缺失的非必需基因,且重组病毒稳定等特点。近几年,随着猪PRV基因缺失疫苗研制成功,以PRV为载体表达其他外源蛋白构建重组病毒已成为基因工程疫苗的研究热点,其中以PRV-Bac最为突出。开展表达PEDV-S蛋白的重组伪狂犬病毒研究具有重要的现实意义。通过对2011-2016年12株浙江省临床分离的PEDV毒株S和ORF3基因进行测序和分析,结果表明,12个样品株都属于PEDV的第Ⅰ群,与Genbank中所登录的近几年年中国分离株(BJ-2011和HuN)S基因的氨基酸序列同源性高达97.8%-99.9%,而与中国国内疫苗株CV777和韩国弱毒疫苗株DR13的氨基酸同源性仅在93.3%-94.9%之间。12株样品株ORF3彼此之间的氨基酸序列同源性为96.9%-100%,其中NB120929、FY140714和HZ150314三个毒株的S基因氨基酸序列同源性为100%,可以选用其中任何一个作为流行株。其与疫苗株CV777的同源性为95.6%-96.4%,与中国分离株BJ-2011的同源性为97.8%-99.6%,与韩国毒株chinju99和DR13的同源性为96.9%-99.6%。2011-2016年浙江省PEDV的S和ORF3基因的遗传进化关系表明,主要为S基因突变。通过分析S和ORF3基因的遗传进化关系,筛选出近年来浙江省PEDV流行毒株(FY140714),并优化流行毒株的S1和S2两段基因序列,使其适于在真核系统中进行表达;通过Red E/T两步重组将优化后的S1和S2基因分别插入到pPRV-Bac-EF1,构建缺失gE和gI基因的pPRV-S1-ΔgIE和pPRV-S2-ΔgIE突变体,用磷酸钙转染的方法拯救出具有感染性重组病毒,分别命名为rPRV-S1-ΔgIE和rPRV-S2-ΔgIE;在L-阿拉伯糖的诱导下删除pPRV-S1-ΔgE和pPRV-S2-ΔgE突变体中的Kan基因,再次拯救出rPRV-S1-ΔgIE和rPRV-S2-ΔgIE重组病毒。Western blot结果表明两个重组病毒分别能在BHK-21细胞内表达S1和S2蛋白;通过免疫小鼠试验,证明rPRV-S1-ΔgIE重组病毒表达的S1蛋白具有较好的免疫原性,而rPRV-S2-ΔgIE重组病毒表达的S2蛋白免疫原性较弱。为进一步研制PRV和PEDV二联重组活载体疫苗奠定了基础。
【图文】：

且发病后的临床表现也极其相似。这两种病毒粒子具有典型的冠状病毒形态：都表现为多形性，大多数呈球形，直径在90 nm-190 nm左右，平均直径为130nm，外部有囊膜包裹，囊膜上有呈放射状排列的花瓣状纤突（图1-2A和1-2B分别展示了PEDV粒子的模式图和电镜图）。而且这两种病毒的抵抗力均较弱，大多数消毒药即可将其杀死，对乙醇和氯仿等脂溶性溶剂的敏感度较高。在4 ℃，pH 5.0-9.0和37 ℃，pH 6.5-7.5时病毒的感染力几乎不会受到影响，特性比较稳定。

.3 PEDV基因组特征PEDV属于RNA病毒，基因组结构（图1-3）是单股正链RN A PEDV 电镜图 B PEDV 结构 A Electron microscope pictures of PEDV B The schematic diaAB图 1-1 PEDV 分类地位(摘自国际病毒分类委员会第八次报告g.1-1 Taxonomic status of the PEDV(From The Eighth Report of InternationaTaxonomy of Viruses)
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65

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本文编号：2561181