猪瘟病毒C、NS3蛋白多克隆抗体的制备及其与IRG6相互作用的初步探索
发布时间：2019-11-16 06:08
【摘要】：猪瘟病毒(CSFV, Classicsl swine fever virus)是引起猪的高度传染性致死性疾病——猪瘟的病原。CSFV感染可导致猪严重的白血球减少症、免疫抑制、广泛的血栓症和内皮损伤,给世界养猪业带来巨大的威胁和经济损失。CSFV是一种小囊膜、单股正链RNA病毒,属于黄病毒科、瘟病毒属,基因组约12.5 kb,只有1个大的开放阅读框架(ORF, Open reading frame),所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码,编码的多聚蛋白约4000个氨基酸残基,分子量约438 kDa,在细胞和病毒蛋白酶的加工、修饰下形成12种成熟的病毒蛋白。本研究小组先前的研究证实,在猪瘟病毒感染的过程中IRG6(Inflammatory response gene 6 protein)的mRNA表达量一直处在非常高的水平。通过NCBI BLAST系统发现,在基因结构上IRG6与其他物种的viperin有非常高的同源性,达到83.7%,主要功能区域的同源性达到90%。蛋白质的结构和功能是密不可分的,IRG6与viperin结构上的高度同源性提示其必然在功能上与viperin有着高度相似性。在感染猪瘟病毒过程中,IRG6的mRNA高水平表达也说明其与猪瘟病毒感染的密切关系。本文通过亚克隆的方法以pET-32a(+)原核表达载体为基础构建了pET-C和pET-NS3原核表达质粒。将pET-C和pET-NS3转化到大肠杆菌Rosetta (DE3)并进行诱导表达,成功获得重组蛋白C和NS3。通过Ni2+的亲和层析法纯化了重组蛋白C和NS3,并将以包涵体形式表达的重组蛋白NS3进行了复性,制备出可溶性抗原,将重组蛋白C和NS3免疫小鼠制备出抗C蛋白和NS3蛋白蛋白多克隆抗体。Western blot检测C蛋白和NS3蛋白多克隆抗体,二者能够分别与重组蛋白C和NS3发生良好反应。进一步检测多克隆抗体的特异性和反应性,C蛋白多克隆抗体和NS3蛋白多克隆抗体能与天然构象的猪瘟病毒C蛋白和NS3蛋白结合,两种抗体的最适稀释度均达到1：2000,证明所制备的两个多克隆抗体具有良好的反应性和特异性。运用实时荧光定量PCR技术、Western blot和IFA检测稳定转染peGFP真核表达载体的PK-15细胞系、稳定转染pIRG6-eGFP真核表达载体的PK-15细胞系和PK-15细胞发现,证实过表达IRG6蛋白会使猪瘟病毒RNA、病毒蛋白和病毒滴度水平下降,暗示IRG6可能具有抑制猪瘟病毒复制的生物学活性。
【图文】：
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本文编号：2561704
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