检测PRRSV抗体的两种间接ELISA方法的建立和应用

发布时间：2019-11-26 10:13

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种以怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍和仔猪与育肥猪的呼吸道症状为特征的传染病,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。因此,建立有效的诊断PRRSV方法是非常重要的。PRRSV核衣壳蛋白N,是病毒主要的结构蛋白,并且具有很强的免疫原性,是该病毒血清学诊断方法中应用最多的靶抗原。PRRSV的非结构蛋白Nsp9蛋白,即RNA依赖RNA聚合酶(RdRp),其仅在病毒的复制过程中产生,高度保守。基于此,本研究就利用原核表达系统诱导表达PRRSV N和Nsp9蛋白为包被抗原,建立了检测PRRSV抗体的两种间接ELISA方法(N-iELISA和Nsp9-iELISA),用以诊断PRRSV的感染及区分PRRSV灭活疫苗和弱毒疫苗(或者野毒)的感染,在临床上具有一定免疫监控和疫病净化的应用。首先,建立检测PRRSV N和Nsp9抗体的间接ELISA方法,即N-iELISA和Nsp9-iELISA。利用表达PRRSV的N和Nsp9蛋白的的原核表达菌株,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现N和Nsp9蛋白分别以包涵体和可溶蛋白形式成功表达。Ni柱纯化的两种蛋白为包被抗原,建立间接ELISA,并利用PRRSV阴性血清,确定两种间接ELISA方法阴阳性血清判断临界值分别为0.172和0.32。其次,计算建立的两种间接ELISA的与Western blot、IDEXX ELISA的符合率。从PRRSV人工感染的猪血清中抽取62份猪血清,进行Western blot检测,其结果与N-iELISA和Nsp9-iELISA检测结果的符合率分别为95.16%和87.10%。另外,用商品化的IDEXX ELISA抗体检测试剂盒检测送检的37份临床猪血清,结果与N-iELISA和Nsp9-iELISA检测结果的符合率分别为91.89%和81.08%。最后,应用建立的两种间接ELISA。分别检测攻毒不同PRRSV毒株后,收集的不同天数猪血清,分析针对N和Nsp9产生的抗体滴度的变化规律。结果表明,PRRSV感染后7天左右和14天(攻毒株为PRRSV CH-1R,或者21天攻毒株为PRRSV SD-16)全部猪只都可分别检测到N和Nsp9蛋白的抗体,且攻毒后前30天内Nsp9蛋白产生的抗体滴度随着攻毒天数的逐渐升高,而N蛋白后期略微下降。同时,分别检测临床收集的陕西和山东不同地区的104份为免疫PRRSV灭活疫苗的猪血清,其阳性率分别为93.27%和2.88%;552份是免疫PRRSV弱毒疫苗的猪血清,其阳性率分别为89.85%和81.34%。综上所知:本研究成功的建立检测PRRSV抗体的两种间接ELISA方法。应用这两种方法成功的诊断PRRSV的感染及区分PRRSV灭活疫苗和弱毒苗(或者野毒)的感染。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【参考文献】