牛分支杆菌ag85a基因重组乳酸菌的构建及免疫研究

发布时间：2019-11-26 21:29

【摘要】：牛结核病(Bovine tuberculosis)是一种威胁着人类健康、妨碍着畜牧业发展的慢性消耗性人畜共患传染病。牛结核病的传染成全球性,发病没有明显的季节性,宿主十分广泛牛最易感,人、猪、禽类和野生动物也可患病。人类与牛通过牛的饲养、牛产品的消费等多种途径上密切联系着,迫使人类容易感染就结核病,人类的健康受到严重威胁。目前为止,预防结核病的惟一有效的疫苗仍为卡介苗(BCG)。由于BCG的免疫保护力不断降低,免疫缺陷疾病病例不断增加,免疫缺陷的个体不能被BCG保护;而且,BCG免疫容易受环境中分支杆菌的影响导致失败。因此,改进BCG或研制更为安全高效的新型结核病疫苗是世界各国着重研究的热点。Ag85复合物主要包括Ag85A、Ag85B和Ag85C,是结核分支杆菌早期的细胞外分泌性抗原。其中,Ag85A组分是其中分泌率较高的,引起机体的细胞免疫应答较显著,是结核病亚单位疫苗的理想抗原研制;由ag85a构建的DNA疫苗可引发抗结核免疫应答,因此是DNA疫苗的理想候选基因。近年来,ag85a以其优秀的免疫原性使得多种携带ag85a基因的结核疫苗已进入了临床试验研究,成效理想。乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)隶属革兰氏阳性菌,是一类应用在食品中最广泛的工业菌株。乳酸菌与人类关系密切,一些是机体肠道内的正常菌群,对机体起着有益的作用。在食物腐败的防治、免疫力的提高以及风味的改善等方面乳酸菌起着重要作用。对乳酸菌分子结构、基因组成及其独特性质的研究不断深入,除食品工业外乳酸菌的应用领域也逐渐扩大。人们以乳酸菌为宿主菌,构建用于表达异源蛋白表达载体,取得了重大的研究进展。由于有些乳酸菌是人和动物肠道的正常菌群,食品级安全乳酸菌载体可以递呈抗原分子,制成与肠道粘膜直接作用的口服疫苗,可取得良好的免疫效果。本研究通过PCR技术扩增了牛结核杆菌ag85a基因,并与pMD18-T Sample Vector连接,构建了重组克隆质粒pMD18-T(S)-ag85a。通过限制性内切酶KpnⅠ和NcoⅠ酶切重组质粒pMD18-T(S)-ag85a和乳酸菌表达载体pNZ8149,将ag85a基因插入pNZ8149表达载体中,构建重组表达质粒pNZ8149-ag85a。将重组表达质粒pNZ8149-ag85a电转入宿主菌NZ3900构建重组乳酸菌,以获得携带了目的基因Ag85a的重组乳酸菌。经10ng/mL Nisin诱导,SDS-PAGE分析表明基因成功表达分子质量约为31kDa的蛋白。将此重组乳酸菌饲喂小鼠,研究分析小鼠的免疫应答反应。为研究重组乳酸菌pNZ8149-ag85a/NZ3900作为牛结核病新型疫苗奠定了基础。
【图文】：

电泳图,电泳,基因扩增,琼脂糖凝胶电泳

18图 1.1 ag85a 基因的扩增产物电泳Fig.1.1 Result of PCR amplificationM：DL2000 DNA Marker1：ag85a 基因扩增产物回收纯化 1%琼脂糖凝胶电泳分析结果如图

基因,产物,感受态,重组质粒

图 1.2 ag85a 基因 PCR 回收产物Fig.1.2 Result of PCR extractionM：DL2000 DNA Marker1：ag85a 基因 PCR 产物回收T Simple Vector 重组质粒的提菌 DH5α 感受态中，，提取质
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.12

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