表达高致病性禽流感（AIV H5N1）HA重组鸭瘟病毒的构建与鉴定

发布时间：2019-11-28 15:31

【摘要】：H5N1 亚型禽流感病毒(Avian influenza viurs H5N1 subtype,AIV H5N1)作为一种高致病性的流感病毒而备受社会的关注。目前,在国内外灭活苗一直是防控禽流感的主要手段。但灭活苗免疫效果不理想,不能高效诱导T细胞免疫,不能区分自然感染和疫苗免疫产生的抗体,而且在禽流感灭活苗制备时有散毒风险。因此,研制安全、高效的新型疫苗已成为当务之急。病毒活载体疫苗能高效表达病原的保护性抗原。不仅如此,其诱导机体产生体液免疫的同时,亦诱导产生高效细胞免疫,从而可以达到有效清除抗原的目的。病毒活载体疫苗已成为当前新型疫苗的研究热点。鸭瘟病毒(Duck enteritis virus,DEV)作为疱疹病毒中的一员,具有较大的基因组结构(基因组大约为158Kbp),而且包含许多生长非必需的基因序列,这些基因序列的删除与替换并不影响DEV的生长特性。而且鸭瘟弱毒疫苗是一种广泛应用的疫苗。由于DEV的上述特性,可作为表达外源基因的载体病毒。为了使重组DEV活载体疫苗的研制更为简便高效,本实验室构建了 DEV的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromose,BAC),并以之为基础,将合成的带有pMCMV启动子的HA表达盒插入DEV BAC的UL55和LORF11之间的非编码区,构建成重组DEV BAC(pDEVC-KCE-H5(UL55))。随后通过比较重组BAC(pDEVC-KCE-H5(UL55))与亲本BAC(pDEVC-KCE)的基因图谱进行鉴定,结果与预期一致。然后,我们将带有上、下游同源臂且含有gC基因的片段与pDEVC-KCE-H5(UL55)的DNA通过共转染CEF的方法成功拯救出恢复了 gC基因的重组毒——DEV-H5(UL55),并且证明DEV-H5(UL55)的生长特性与亲本毒(DEVC-KCE)无显著的差异。将DEV-H5(UL55)接种CEF通过间接免疫荧光和Western Blotting证明外源基因(HA)能够稳定地表达。对构建好的重组毒的生物学特性进行相关的研究及验证后,进行了动物实验。结果表明,仅用106 TCID_(50)的DEV-H5(UL55)免疫接种商品鸭就可对DEV强度攻击产生100%的免疫保护。而在免疫3周龄商品蛋鸡体内亦检测到HI滴度,其峰值达8.2log2。然而当对 1 周龄 SPF 鸡接种 106TCID_(50) DEV-H5(UL55)却导致了 60%(6/10)的死亡率,此外,即使对商品鸭接种107 TCID_(50)DEV-H5(UL55),其诱导产生的HI效价也很低。通过本研究可以得到以下结论:(1)本实验中所构建的BAC含有DEV vaccine strain C-KCE株的全基因组;(2)HA基因插入到UL55和LORF11之间不会影响DEVC-KCE的生长特性;(3)DEV-H5(UL55)能对鸭瘟产生100%免疫保护;(4)尽管DEV-H5(UL55)对1周龄SPF鸡有一定的毒力,但能诱导3周龄商品鸡产生较强的体液反应;(5)DEV-H5(UL55)诱导商品鸭产生的HI效价较低。
【图文】：

图１－１禽流感病毒的结构逡逑Ｆｉｇｌ－１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｍｃｔｎｉｅ邋ｏｆＡＩＶ邋（Ｆｒｏｍ邋Ｈｕ，邋Ｘ，邋ｅｔ邋ａｌ．２０１１）逡逑凝素糖蛋白，具有红细胞凝集的功能，能使驴、马、猪、生凝集现象。但有趣的是，ＨＡ不能使兔的红细胞产生凝集效

逑位于基因内部的重复序列称为内部重复序列（Ｉｎｔｅｒｎａｌ邋Ｐｅｐｅａｔｅｄ邋Ｓ巧ｕｅｎｃｅｓ，邋ＩＲＳ）邋口９，逡逑４０］，其基因组结构为ＴＲＳ－ＵＬＩＲＳ－ＵＳ－ＴＲＳ邋（如图１－２）。逡逑Ｔ民逦ＩＲ逦Ｔ民逡逑■■■逦■■■逦逡逑ＵＬ逦ＵＳ逡逑图１－２疮疼病毒的基因组结构逡逑Ｆｉｇ邋１－２．邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｅｉｋ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｔ邋ｈｃｒｐｅｓｖｉｍｓ逡逑有关鸭磕序列研究进展的报道较晚，直至１９９８年Ｎｕｍｍｅｒ等首次报道了邋ＵＬ６和逡逑ＵＬ７的部分基因序列。至此，人们才得Ｗ初步ｒ解鸭磕摘蜡的甚因结构［４Ｕ。韩先杰逡逑等利用ＰＣＲ方法成功扩增了完整的鸭磕病毒化、ｇＨ、化２４序列和部分ＵＬ２５、ＵＬ２６逡逑序列［４２］。随后，陆续有鸭磕病毒基因组序列被上传至Ｇｅｎｂａｎｋ中［３Ｗ，如ＵＵ－ＵＬ３５、逡逑ＵＬ４５－ＵＬ５０、ＵＳ１、ＬＯＲＦ３，总共有４５个基因的ＯＲＦ。直到２００９年，Ｌｉ等首次报道逡逑了邋ＤＥＶ邋ＶＡＣ强毒株的全基因组序列。２０１１年，Ｗａｎｇ等报道了欧洲强毒株ＤＥＶ邋２０８５逡逑株全基因组序列［４１，４２］。如今，，鸭磕基因组的研究己日益透彻，除末端巧纽节列Ｗ及逡逑ＵＳ、ＵＬ区结合部位的巧因序列外Ｉ巧他巧列组成己陆续被发表，占全益因组的８０％逡逑左右［４０
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【参考文献】

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本文编号：2567077