PRRS耐热糖玻璃疫苗制备工艺的研究

发布时间：2019-11-29 06:20

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以感染猪发热、厌食,妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎,各种年龄猪(特别是仔猪)呼吸障碍为特征的高度传染性疾病,对养猪业造成重大危害,免疫注射活疫苗是预防该病最有效的方法之一。目前国内外的活疫苗生产主要是采用真空冷冻干燥技术,在2～8℃条件下保存1.5-2年,保存、运输及使用均需要依赖"冷链"系统。本研究采用新型梯度真空泡沫干燥方法,研究以海藻糖等为主要成分的PRRS耐热糖玻璃疫苗,以期获得更高的耐热储存性能,能够摆脱"冷链"依赖的高品质疫苗。研究首先对海藻糖、蔗糖、胰蛋白胨、EDTA、明胶等成分进行耐热配方单因素分析,以37 ℃耐老化试验、残余水份为筛选指标,获得最佳配方;再对泡沫干燥疫苗的形态结构、玻璃化转变温度等进行工艺参数优化;最后通过保存期和免疫效果确立PRRS耐热糖玻璃疫苗的实验室制备工艺,为工业化生产提供技术支撑。1.泡沫干燥疫苗保护剂配方的筛选为了挑选耐热性能较好的保护剂,试验选取了蔗糖、海藻糖、明胶、胰蛋白胨等成分,采用单因素设计进行成分的添加与配伍,在相同的真空干燥程序下,进行真空泡沫干燥疫苗的制备。将干燥制品进行37 ℃耐老化试验,首先发现T28配方泡沫干燥疫苗10d的耐老化损失低于0.5 Lg,优于其他配方。然后在此基础上继续优化得到T28C-1、T28C-5、T28C-6、T28C-8配方,制备的泡沫干燥疫苗37 ℃保存10d的耐老化损失Lg值分别是0.43、0.30、0.44和0.38。2.泡沫干燥疫苗制备程序的优化泡沫干燥工艺不仅影响疫苗的物理性状,也影响疫苗制备过程中的效价损失和耐热性能。本研究在原有新城疫泡沫干燥工艺的基础上进行调整,得到初筛结果较好的T28基础耐热配方,能够稳定形成泡沫并保持较低的病毒滴度损失;进一步调整不同的分液量、控制隔板温度和真空下降速率制备泡沫干燥疫苗,挑选得到T28C耐热疫苗,并对不同泡沫形态的疫苗进行物理性状与耐热活性比较,发现不同形态泡沫干燥疫苗的病毒TCID50差异不大,同一批次泡沫干燥疫苗中形成较膨胀的泡沫、泡沫体积大于瓶高1/2且形态较为规则、无沾壁现象的疫苗病毒滴度检测Lg值是6.7±0.08;有沾壁现象、泡沫形态不规则、杂乱的疫苗病毒滴度检测Lg值是6.5±0.11;泡沫未完全膨胀开、聚在瓶底的疫苗病毒滴度检测Lg值是6.6±0.07。3.泡沫干燥疫苗理化特性的研究结合前两章成功获得最佳配方和制备工艺,在实验室试制了几批PRRS泡沫干燥疫苗,所得到的T28C系列耐热保护剂疫苗呈现了致密的乳白色泡沫状,具有泡沫疏松、高度较为均一(达到1/2瓶～2/3瓶高)、表面积大有利于水分蒸发等特点,并从微观上进行扫描电镜的图片展示;参考《中华人民共和国兽用生物制品规程》相关方法进行了外观性状、残余水分、耐老化试验等测定,T28C-1、T28C-5、T28C-6和T28C-8配方的残余水分为2.9%、2.86%、2.94%、2.88%,均低于3%,能够更好地保存,结合对37 10 d的耐老化试验结果T28C-1、T28C-5、T28C-6和T28C-8配方制备的泡沫干燥疫苗在37 ℃保存10d的耐老化损失Lg值分别是0.43、0.3、0.44、0.38,可以挑选出T28C-5、T28C-6为最佳配方;同时通过T28C-5、T28C-6配方制备的泡沫干燥疫苗测定玻璃化转变温度(Tg),得到与病毒液配苗后的液体状态下分别是-33.68 ℃、-33.82 ℃,经泡沫干燥工艺制备的PRRS干燥疫苗分别是56.1 ℃、57.45 ℃,比冻干商品苗的玻璃化转变温度高12 ℃C。4.泡沫干燥疫苗的质量研究为了更好地检测泡沫干燥疫苗的耐热性能,将实验室制品放置4℃、25℃、37℃和室温等多种环境,定期进行病毒含量和残余水分的体外测定,确定疫苗的保存条件和保存期;同时进行体内免疫学测定,评价疫苗的免疫效果。结果表明,T28C-1、T28C-8配方分别在37℃ 80 d、25 ℃ 120 d、自然环境下保存120 d之后病毒滴度损失均超过1.0 Lg,而采用T28C-5、T28C-6配方制备的PRRS泡沫干燥疫苗在37 ℃保存4个月,病毒滴度损失1.0 Lg;在25℃保存150天,病毒滴度损失仍然0.8 Lg;在自然环境下保存150 d病毒滴度损失仍然0.6 Lg。综合得到T28C-5配方展现出显著的耐热性能。进一步的体内试验结果表明,T28C-5泡沫干燥疫苗在37℃、25℃和4 分别保存3个月后免疫仔猪,免后2周、3周、4周后采血进行ELISA测定。抗体水平检测呈较高的阳性水平,4 ℃保存的泡沫干燥疫苗在免疫后4周的抗体水平能够达到商品冻干苗的同等水平。
【图文】：

干燥曲线,干燥曲线,细胞板,耐老化

图２－１泡辣干燥一次干燥曲线逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｄｒｙｉｎｇ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ｆｏａｍ邋ｄｒｙｉｎｇ逡逑（４）泡沫干燥疫苗的病毒含量及耐老化的测定对培养４８邋ｈ后长满的Ｍａｒｃ－１４５逡逑细胞，经膜酶消化并按照１．２５Ｘ１０５个／ｍｌ的密度铺９６孔细胞板，细胞板在３７邋‘Ｃ和５％逡逑－１

耐老化,糖浓度

２．１初筛配方的耐老化试验结果逡逑对初筛的耐热保护剂配方进行耐老化测定，巧’Ｃ保存１０邋ｄ病毒滴度损失在１．０逡逑ＬｇＴＣＩＤｓｏ内为标准，根据图２－２结果筛选配方作进一步研究。逡逑！■邋４邋厂邋Ｔ１邋３逡逑0邋１．２邋－逡逑配方巧朽逡逑图２－２配方初筛耐老化结果逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ａｎｔｉ－ａｇｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ邋ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ逡逑Ｔ１３？Ｔ１７几个耐热保护剂配方所含的糖浓度较高，但耐老化试验的结果均是疫苗逡逑的耐老化损失大于１．０邋Ｌｇ值，而之后降低糖浓度的耐热配方反而在耐老化方面有一定逡逑的改善，尤其是Ｔ２８耐热保护剂配方，耐老化损失能在０．５邋Ｌｇ左右，在一系列对成分逡逑调整的耐热配方中损失最低，选择进一步优化的优化调整。逡逑１６逡逑
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S859.797

【参考文献】