蒙古阿尔巴斯白绒山羊毛囊发育过程中VEGF相关信号通路的研究

发布时间：2019-11-30 14:20

【摘要】：VEGF是一种促进血管生成的生长因子,在小鼠中已被证实可以促进毛发生长。而VEGFR-2作为VEGF最初的受体,对VEGF功能起到调节作用。VEGF在人类真皮毛乳头细胞中被证实能够通过VEGFR-2激活Erkl/2信号通路进而促进细胞的生长。在本研究中我们以通过转基因手段获得的产绒量明显提高(10048)以及产绒量未发生明显改善(10056)的内蒙古阿尔巴斯转VEGF基因白绒山羊做为研究对象,同时以同一细胞系体细胞克隆羊做为对照(NT),运用Real time-PCR以及Western Blot技术探究了VEGF以及VEGFR-2在皮肤组织中的表达情况,以及VEGF转基因对皮肤组织中细胞相关信号通路的影响。通过实时定量PCR检测NT、10056和10048皮肤组织中VEGF及相关信号通路基因mRNA的表达情况。结果显示,10056转基因绒山羊皮肤组织中VEGF表达量与NT没有显著差异,但其VEGFR-2的表达量较NT高,差异显著(P0.05)；而10048转基因绒山羊皮肤组织中VEGF的表达量相较于NT高,差异显著(P0.05),VEGFR-2的表达量相较于NT高,且差异极其显著(P0.01)。检测VEGF信号通路相关基因包括：PI3K,Akt,RelA, β-catenin, HIF1-α结果显示,10048转基因绒山羊皮肤组织中β-catenin和PI3K基因的表达量与NT无显著差异,HIF1-α的表达量较NT高,差异显著(P0.05)。10056转基因绒山羊皮肤组织中β-catenin的表达量较NT高,差异显著(P0.05), HIF1-α和PI3K的表达量较NT低,差异显著(P0.05)。通过蛋白质免疫印迹实验检测三个绒山羊皮肤组织中VEGF、 VEGFR-2基因以及相关信号通路基因的蛋白表达结果显示,10056转基因绒山羊皮肤组织中VEGF的表达量较NT绒山羊皮肤组组织高,为1.4倍；VEGFR2表达量较NT低,为0.9倍；Erk1/2、P-Erk、F-Akt、P38、P-P38的表达量较NT高,分别为1.54、1.14、1.92、1.3、3倍；Akt的表达量较NT低,为0.92倍。10048转基因绒山羊皮肤组织中VEGF的表达量较NT高,为1.1倍；VEGFR-2表达量较NT高,为3.1倍；Erk1/2、 P-Erk、P-Akt、P38、P-P38的表达量较NT高,分别为1.74、1.1、1.24、1.19、2.26倍；Akt的表达量较NT低,为0.9倍。上述结果表明,产绒量明显提高的转基因绒山羊(10048)相较于同一细胞系体细胞克隆羊(NT),其皮肤组织中VEGF以及VEGFR-2基因的表达量升高,并且VEGF的高表达通过VEGFR-2引起Erk1/2表达上调,P-Erk1/2表达上调,因而激活了Erk1/2信号通路。且引起P38以及Akt基因的磷酸化情况上调。另外,本研究还利用内蒙古阿尔巴斯白绒山羊处于生长期的次级毛囊毛乳头细胞(Secondary hair follice dermal papilla cells, SHF-DPCs)作为实验材料,进行VEGF基因的过表达以及干扰实验,探究VEGF,VEGFR-2基因以及相关信号通路基因表达情况的变化。通过实时定量PCR检测VEGF过表达和敲减后VEGF和VEGFR-2在SHF-DPCs中mRNA的表达情况,结果表明电转VEGF164干扰质粒1(I-1)后SHF-DPCs中VEGF mRNA的表达量较电转空质粒(NC)后低,差异显著。电转VEGF 164干扰质粒2(I-2)后SHF-DPCs中VEGF mRNA的表达量较NC低。电转VEGF 164过表达载体(O-V)后SHF-DPCs中VEGF mRNA的表达量较NC高,且差异显著；VEGFR-2 mRNA的表达量较NC高。通过蛋白质免疫印迹实验检测VEGF过表达实验和干扰实验中VEGF和VEGFR-2蛋白的表达情况,结果显示,I-1中VEGF、VEGFR-2的表达量相对NC中的表达量分别为0.6倍、0.69倍；I-2中VEGF、VEGFR-2的表达量相对于NC中的表达量分别为0.86倍、0.92倍；O-V中VEGFR、VEGFR-2的表达量相对于NC中的表达量分别为1.14倍、1.4倍。通过蛋白质免疫印迹实验检测VEGF过表达实验和干扰实验中VEGF、VEGFR-2相关信号通路基因蛋白的表达情况,包括Erk1/2、 P38和Akt基因。结果显示I-1中Erk1/2、P38、Akt的表达量相对于NC中的表达量分别为0.82倍、1.01倍、0.59倍。I-2中Erk1/2、P38、 Akt的表达量相对于NC中的表达量分别为0.92倍、0.89倍、0.32倍。O-V中Erk1/2、P38、Akt的表达量相对于NC中的表达量分别为0.84倍、1.44倍、0.69倍。上述结果表明在SHF-DPCs的VEGF过表达实验和干扰实验中,VEGFR-2的表达量与VEGF表达量成正相关。这些结果为在内蒙古阿尔巴斯白绒山羊毛囊的发育及生长过程中VEGF相关信号通路的研究提供了实验依据。
【图文】：

序列,过表达,载体,结构框架

ＶＥＧＦ１６４千扰载体１的基因干扰祀位点的位置及载体的详细报告单见图１，逡逑ＶＥＧＦ１６４干扰载体２的基因干扰祀位点的位置及载体的详细报告单见图２，逡逑ＶＥＧＦ１６４基因过表达质粒的载体图见图３。空质粒为携带一个启动子启动绿色逡逑焚光蛋白的骨架质粒。逡逑载体名称．．逦ｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ－ＶＥＧＦ１６４－ｓｈＲＮＡ－３０９．＇逦产品包装５００邋ｎｇ／ｕｌ，共邋５０邋ｕｇ－逡逑粑序列－逦ＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＣ．逡逑５＊３邋ＣＡＣＣＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧ＾逡逑ＳｈＤＮＡ－逦ＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＧＧＷＣＡＡＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＣ＾逡逑模板＊逦Ｔｈｅ邋ｍｏｓｔ邋Ｓｔａｂｌｅ邋３＊￣（ｆｃｎｅｒ５Ｂ邋ｂｐ，邋‘１１１．１邋ｋｃａｉｆａｗｌ逡逑席拥．逦ＣＡＣＣＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧ邋５＇逡逑３．邋ｉ！：ＧＴｉＴＡＡＴｌｔｉｉ！：（！：ｉＸｉＴＴＴｉｉＪｊＬＭＴ＾：ＴＣＴＣｃｌＪＪｋＬｉＴＡｉｉ＾ｉＴＷｉｌＧＡ（！：￡ｌｌＪＪＪ＾＾ＣＴＡＧ５－逡逑Ｉ逦逦逦邋．．．．邋，１逡逑转录产物－■邋ＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＣＴＴ＾＾逡逑序列

绒山羊,相关信号,基因,差异显著

通过实时定量ＰＣＲ检测ＮＴ、１００５６和１００４８绒山羊皮肤组织中，ＶＥＧＦ相关信逡逑号通路基因的表达情况。检测基因包括，ＶＥＧＦＲ－２、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＲｅｌＡ、ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ、逡逑ＨＩＦｌ－ａ。如图４，结果显示，１００５６皮肤组织中ＶＥＧＦ表达量与ＮＴ皮肤组织中的逡逑表达量没有显著差异；ＶＥＧＦＲ－２的表达量较ＮＴ高，差异显著（Ｐ＜０．０５）邋；邋Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ逡逑的表达量与ＮＴ的表达量高，差异显著（Ｐ＜０．０５）邋；邋ＨＩＦｌ－ａ和ＰＩ３Ｋ的表达量较逡逑ＮＴ的表达量低，差异显著（Ｐ＜０．０５）。１００４８绒山羊皮肤组织中ＶＥＧＦ的表达量逡逑相较于ＮＴ高，差异显著（Ｐ＜０．０５）邋；邋ＶＥＧＦＲ－２的表达量相较于ＮＴ高，，差异极其逡逑显著（Ｐ＜０．０１）；邋ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ和ＰＩ３Ｋ基因的表达量与ＮＴ的表达量无显著差异；ＨＩＦ１－逡逑ａ的表达量较ＮＴ的表达量高，差异显著（Ｐ＜０．０５）。逡逑１８邋ｎ逦逡逑★邋－ｋ逡逑：：Ｉ逡逑ｊ逦１２邋Ｉ逡逑＾逦１０逦■邋逦逦—－邋逦逦＿邋ＮＴ逡逑？Ｉ＂逦８逦■逦逦■邋１００４８逡逑Ｉ逦６逦醒邋逦逦■邋１００５６逡逑Ｉ邋ｓ—ｍ—ｔ一：逦逡逑“０邋－邋Ｊｌｗ邋Ｉ邋Ｊｒｄｒ逡逑ＶＥＧＦ邋ＶＥＧＦＲ－２邋ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ邋ＨＩＦｌａ邋ＰＩ３Ｋ逡逑图４：邋ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ－２及相关信号通路基因在ＮＴ、１００４８、１００５６绒山羊皮肤组织中的ｍＲＮＡ水平逡逑表达情况。ＮＴ：同一细胞系体细胞克隆羊；１００５６：产线量无显著提高的ＶＥＧＦ１６４转基因域山逡逑羊；１００４８：产域量显著提高的ＶＥＧＦ１６４转基因域山羊。＊差异显著
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S827

【引证文献】