牛疱疹病毒Ⅰ型感染对牛胚气管细胞Toll样受体2表达的影响

发布时间：2019-11-30 23:19

【摘要】：为研究牛疱疹病毒Ⅰ型(BH V-1)对体外非免疫细胞——牛胚气管细胞(EBTr)表达Toll样受体2(TL R 2)的影响,了解TLR2在BHV-1感染时介导的天然免疫反应机制,本试验将EBTr细胞分为BHV-1感染组和对照组,分别收集培养后第6、12、18、24及48小时的细胞总RN A和总蛋白,通过荧光定量PCR和W estern-blot技术,检测感染BHV-1后TLR2在基因和蛋白水平的动态变化。结果显示,在第6和12小时,感染组TLR2 m RNA和蛋白的相对表达量均低于对照组;在第48小时,感染组TLR2 m RNA和蛋白的相对表达量均显著高于对照组(P0.01)。结果表明,BHV-1感染EBTr细胞会影响TLR2 m RNA和蛋白的表达,提示TLR2参与宿主细胞对BHV-1的识别,触发天然免疫,这为探索BHV-1感染的免疫机制提供了依据。
【图文】：

2和β-actin的阳性标准品进行定量PCR扩增，根据不同稀释浓度的Ct值优化最佳检测范围，构建各基因的标准曲线。TLR2和β-actin基因的标准曲线在1×102～1×109copies/L范围内有很好的线性关系，分析获得两基因扩增相关系数R2均为1.000，扩增效率E分别为95.81％和92.26％，标准曲线的各项指标均符合定量PCR检测要求（见图1和图2）。2.2BHV-1感染对EBTr细胞TLR2mRNA的影响用SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法同时扩增TLR2和β-actin基因的阳性标准品和3个平行试验中制备的所有感染组、对照组EBTr细胞cDNA，图1TLR2荧光定量PCR的标准曲线Fig.1Thestandardcurveofreal-timePCRforTLR2TLR2copies/L循环数Cyclenumbers324

第3期周伟光等：牛疱疹病毒Ⅰ型感染对牛胚气管细胞Toll样受体2表达的影响0.00150.00100.00050.00006122448感染组lnfectiongroup对照组Controlgroup图3BHV-1感染EBTr细胞后TLR2mRNA的表达变化Fig.3ThemRNAexpressionchangesofTLR2inEBTrcellsafterinfectionwithBHV-1**表示差异极显著（P＜0.01）**Extremelysignificantdifference（P＜0.01）检测TLR2和β-actin复制拷贝数。按Insun等［12］的方法，应用双标准曲线法计算出各检测样品TLR2mRNA的相对表达量，利用GraphPadPrism5.02软件绘制BHV-1感染EBTr细胞后TLR2mRNA的动态变化柱状图（见图3）。从图3中可以看出，在第6和第12小时，攻毒组TLR2mRNA的相对表达量均低于对照组，且第6小时的差异有统计学意义（P＜0.01）；24～48h，攻毒组TLR2mRNA的相对表达量高于对照组，感染第48小时差异极显著（P＜0.01）。2.3BHV-1感染对EBTr细胞TLR2蛋白表达的影响用Western-blot方法检测不同时间点感染组和对照组EBTr细胞TLR2和β-actin蛋白的表达量，结果（见图4）显示，在蛋白相对分子质量为90及43ku处可见特异性阳性条带，分别是TLR2及β-actin蛋白表达。计算两组TLR2蛋白各不同时间点的相对表达量后绘制TLR2蛋白动态变化柱状图。结果（见图5）显示，第6和12小时，感染组TLR2蛋白的相对表达量均略低于对照组；24～48h，攻毒组TLR2蛋白的相对表达量显著高于对照组（P＜0.01）。3讨论BHV-1可引起牛的多系统感染，原发感染时，病毒从破损的皮肤和黏膜进入机体，潜伏在三叉神经节，随着宿主细胞DNA的复制而复制，，形成长期潜伏感染的状态。当宿主抵抗力下降时，潜伏的病毒被再次激活，导致明显临床疾病或亚临床感染，所以机体需要依赖天然免疫和获得性免疫反应来防

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