抗葡萄球菌蛋白P128表达、纯化及其对牛源葡萄球菌的抗菌活性研究

发布时间：2019-11-30 23:46

【摘要】：抗葡萄球菌嵌合蛋白P128是由葡萄球菌噬菌体K细胞壁降解酶活性区与溶葡萄球菌素细胞壁结合区组成的杂合肽,对耐药葡萄球菌具有较强的溶(杀)活性。国外用大肠杆菌成功表达了重组P128,但需两步硫酸铵沉淀和离子交换层析纯化。本课题组以类弹性蛋白多肽(Elastin-likepolypeptide,ELP)为纯化标签,用脑膜炎奈瑟氏菌FrpC蛋白自加工元件切割ELP标签,但切割效率较低,重复性较差。烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)蛋白酶是该病毒核包涵体蛋白酶的催化活性区,具有识别序列特异性强、切割活性受目的蛋白氨基酸序列影响小和反应兼容性好等优点。本课题组研制的自聚肽融合TEV蛋白酶不仅可用离心洗涤法分离纯化,而且切割反应结束后能用离心法去除。本研究探索用自聚肽融合TEV蛋白酶切割ELP标签可行性,旨在提高重组P128产量,为相关基因工程产品开发打好基础。用PCR扩增P128编码序列,5'端引入TEV蛋白酶切割位点,将PCR产物插入融合表达载体pELP-Fh8,用重组载体pELP-Fh8-P128转化大肠杆菌,对IPTG浓度等表达条件进行了优化,结果显示ELP-Fh8-P128融合蛋白获得正确表达,表达产物为可溶性蛋白。利用温度敏感相变循化(ITC)纯化融合蛋白,对相变温度和盐浓度进行了优化,经两轮ITC获得的ELP-Fh8-P128融合蛋白纯度达90%。对TEV蛋白酶活性包涵体表达、纯化和切割条件进行了优化,用离心洗涤法获得了高纯度融合蛋白酶。在优化条件下切割ELP-Fh8-P128融合蛋白,用ITC去除ELP-Fh8标签,结果显示切割效率高达95%,获得的重组P128纯度达98%,产量为75mg/L细菌培养。收集奶牛乳房炎相关金黄葡萄球菌11株,凝固酶阴性葡萄球菌31株,通过药敏试验筛选耐头孢西丁菌株7株,进而用重组P128分别进行抑(杀)菌试验,用MTT法检测P128对牛肾细胞的细胞毒性。结果显示:除对1株耐头孢西丁金黄和沃氏葡萄球菌无效外,重组P128对9株金黄葡萄球菌的抑菌活性在0.23～0.94μg/ml之间,杀菌活性在0.94～15μg/ml之间;对6种凝固酶阴性葡萄球菌的抑菌活性在0.12～1.88μg/ml之间,杀菌活性在0.94～30μg/ml之间;对耐头孢西丁葡萄球菌的抑(杀)菌活性低于敏感菌株;对牛肾细胞无明显细胞毒性。
【图文】：

可逆相变

图１邋ＥＬＰ的可逆相变逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｉｎｖｅｒｓｅ邋ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＥＬＰ逡逑重组蛋白纯化中的应用逡逑研宄发现不光ＥＬＰ单体具有可逆相变的的特性，与其重组表达的融合蛋白同

流程图,分离纯化,流程图,烟草蚀纹病毒

Ｆｉｇ．邋２邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ＩＴＣ邋ｆｏｒ邋ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ逡逑３．邋ＴＥＶ蛋白酶逡逑烟草蚀纹病毒（Ｔｏｂａｃｃｏ邋ｅｔｃｈ邋ｖｉｒｕｓ，ＴＥＶ）是Ｍｍｓｏｎ（１９３０）从感病烟草、番茄、辣椒逡逑和矮牵牛上首次分离到，是马铃薯Ｙ病毒重要成员，感染宿主较为广泛，可以侵染１９科逡逑１２０余种的双子叶植物１４６］，烟草蚀纹病毒蛋白酶（Ｔｏｂａｃｃｏ邋ｅｔｃｈ邋ｖｉｒｕｓ邋ｐｒｏｔｅａｓｅ，邋ＴＥＶＰ）是逡逑来源于烟草蚀纹病毒（ｔｅｖ）邋Ｎｌａ（核包含蛋白基因）的重组蛋白酶。ＴＥＶＰ是由２４２个氨基逡逑酸组成的２７ＫＤａ蛋白，因其具有高活性、高度的特异性以及作用条件（如温度、ＰＨ、离逡逑ｆ强度等）的宽容性等优点，所以被广泛用于切除标签［４７］。与因子Ｘａ，肠肽酶和凝血酶逡逑相比，，没有关于ＴＥＶＰ融合蛋白发生位点错误切割的报道。由于在ＴＥＶＰ中三联体逡逑（Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｈｉｓ）中的Ｓｅｒ被Ｃｙｓ取代，因此ＴＥＶＰ蛋白酶能够耐受如ＰＭＳＦ、ＥＤＴＡ、ＡＥＢＳＦ逡逑等多种蛋白抑制剂，而且尽管在低温中，ＴＥＶＰ也能起到很好的酶切效果。Ｓｉｍ等的研宄逡逑表明即使在较高的变性剂存在时，ＴＥＶＰ仍能保持其部分活性ＴＥＶＰ与其他酶不同的逡逑一
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.611

【参考文献】