西尼罗病毒快速检测方法的建立与应用

发布时间：2019-12-02 02:43

【摘要】：西尼罗病毒病是由西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)感染引起的急性虫媒传染病,该病可感染鸟类、马属动物以及人类,引起宿主隐性感染、轻微发热、脑脊髓炎、脑炎、甚至死亡等不同程度的临床症状。由于该病长期威胁着人类健康,给发病国家和地区带来严重的经济损失及人员伤亡,已受到世界卫生组织(World Health Organization,WHO)和世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)的关注,且位列全球重大流行病榜单。近来研究显示:在中国、韩国、日本等乙型脑炎病毒流行国家的鸟体内存在WNV抗体。我国虽然尚未暴发西尼罗病毒病,但研究者已从新疆地区的蚊虫体内分离得到了WNV病毒,从突发脑炎和发烧病人脑脊液中检测到了WNV抗体。近年来,西尼罗病毒病不断在俄罗斯、印度等邻国发生和流行,且随着国际间交流及人员往来的日益频繁,使得该病在我国暴发的风险大大增加,必须提高警惕。因此,建立针对WNV快速、灵敏、准确的检测方法对于西尼罗病毒病的诊断、预防、治疗和流行病学分析具有重要意义。研究目的:建立可用于WNV抗体检测的间接ELISA方法、WNV核酸检测荧光定量PCR方法和WNV RT-LAMP-VF检测方法,为西尼罗病毒病的流行病学调查、快速诊断、抗体监测和免疫效果评价等提供简单、快速、敏感的检测技术和方法。研究内容:1.WNV抗体间接ELISA检测方法的建立与应用研究。2.WNV核酸检测荧光定量PCR方法的建立与评价研究。3.WNV RT-LAMP-VF检测方法的建立与评价研究。研究方法:1.西尼罗病毒抗体间接ELISA检测方法的建立构建表达WNV E蛋白第三结构域WNV-E DIII的重组质粒p G-EDIII,将之转化入大肠杆菌DE3菌株进行目的蛋白的表达,利用SDS-PAGE电泳及Western blot对目的蛋白进行鉴定,并对目的蛋白进行纯化、透析、浓缩后,-20℃保存备用。利用纯化的目的蛋白作为包被抗原建立WNV抗体间接ELISA检测方法,对ELISA的工作条件进行优化,并对优化后的方法进行特异性、敏感性、重复性评价以及临床样品检测,分析该方法的实用性。2.西尼罗病毒核酸检测荧光定量PCR方法的建立通过对不同谱系、不同年代、不同种属的WNV全基因组序列分析,筛选出WNV全基因组中的保守序列,并以该保守序列为靶位设计、合成一对引物及一条特异性TaqMan探针。以10倍系列稀释人工合成的rna为标准品,进行real-timepcr扩增,绘制标准曲线,建立、优化方法。并对优化后的方法进行特异性、敏感性、重复性评价,分析该方法的实用性。3.西尼罗病毒rt-lamp-vf检测方法的建立以不同谱系、不同年代、不同种属的wnv全基因组的保守区为靶位,针对8个区域设计一套共6条特异性引物,用于环介导恒温扩增反应。通过对反应条件的优化及扩增效率的评估,建立wnvrt-lamp-vf检测方法,对该方法进行特异性、敏感性评价以及模拟临床样品检测,分析其实用性。研究结果:1.构建了表达wnve蛋白第三结构域蛋白wnv-ediii的重组质粒pg-ediii,转化大肠杆菌后目的蛋白主要以包涵体形式表达,当iptg浓度为0.4mm,诱导温度为37℃,诱导时间为3h时该蛋白表达量最高。利用ni-ntahis亲和层析柱进行目的蛋白的纯化,含250mm咪唑的洗脱液洗脱可得到较纯净的目的蛋白。利用纯化后的目的蛋白作为包被抗原建立西尼罗病毒抗体间接elisa检测方法。优化后的elisa最佳工作条件为:抗原包被浓度为10μg/ml,100μl/孔,4℃包被过夜;blockingace封闭液37℃封闭1.5h;待检血清1:80稀释,37℃孵育1.5h;hrp标记的酶标二抗1:20,000稀释,37℃孵育1h。该方法可特异性检测西尼罗病毒抗体阳性血清,与日本乙型脑炎、委内瑞拉马脑炎、东部马脑炎、西部马脑炎抗体阳性血清均不发生交叉反应。elisa的批内和批间重复试验变异系数均小于7%。用该方法对25份临床健康马匹血清样品进行检测,结果表明:wnv抗体均为阴性。同时将优化后的elisa方法应用于疫苗免疫效果的评价,并与alpha公司试剂盒进行比较,两者检测结果具有很好的符合率。2.以人工合成的标准品rna为模板,成功建立了西尼罗病毒核酸检测荧光定量pcr方法。优化后的方法特异性高,在相同条件下不与裂谷热病毒(rvfv)、埃博拉病毒(ebov)、狂犬病病毒(rabv)、东方马脑炎病毒(eeev)、西方马脑炎病毒(weev)相关基因发生非特异性扩增。批内、批间变异系数小,具有良好的准确性和重复性,敏感度较普通pcr高10倍。3.以人工合成的标准品rna为模板,成功建立了西尼罗病毒rt-lamp-vf检测方法。该方法特异性强,不与黄病毒科其他成员发生交叉反应;且该方法敏感度高,可对102拷贝数/μl及以上数量级的标准品进行扩增诊断。以表达wnve蛋白的重组狂犬病病毒rrabv-wnve脑内感染icr小鼠,模拟天然活病毒制备临床样品,成功将建立的西尼罗病毒rt-lamp-vf核酸检测方法应用于临床样品的检测,其对细胞重组毒的检测限(101.5tcid50/ml)与脑组织重组毒的检测限(101.33tcid50/ml)相近,无非特异性扩增反应的干扰。研究结论:1.成功表达并纯化了WNV E蛋白第三结构域蛋白WNV-E DIII,并以其作为包被抗原建立了WNV抗体间接ELISA检测方法。该方法特异性强、敏感度高、重复性好,且与商品化的试剂盒检测结果符合率高。2.成功建立了WNV核酸检测荧光定量PCR方法。优化后的方法特异性强、批内及批间变异系数小,具有良好的准确性和重复性,敏感度较普通PCR高10倍。3.成功建立了西尼罗病毒RT-LAMP-VF检测方法。该方法特异性强、敏感度高,在模拟临床样品的检测中无非特异性扩增反应的干扰,具有临床实用性。且该方法具有简便、快速等优点,尤其适用于基层及偏远地区的检测任务。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

【相似文献】