布鲁氏菌分泌蛋白VceA和VceC对细胞自噬和凋亡的影响

发布时间：2020-02-05 19:31

【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis)由布鲁氏菌引起的动物源性的人畜共患传染病。布鲁氏菌能进入机体并在机体内生存繁殖,逃避机体的免疫系统,机体固有免疫和适应性免疫通过抗感染免疫来监测、防御并清除入侵的病原体。病原体逃避宿主免疫大体上有三种途径,即隐匿、诱变和抑制。隐匿是指布鲁氏菌可能隐匿于自噬体中,干扰自噬体与溶酶体的融合,从而逃避宿主细胞的杀伤;诱变是指病原体通过改变自身的抗原特性,从而逃逸业已诱生的免疫应答的作用;抑制是指布鲁氏菌可抑制宿主细胞凋亡,避免在细胞死亡后被机体的体液免疫和细胞免疫清除,从而保护其在宿主细胞内的长期寄生,并造成持续性感染。IV型分泌系统(Type IV secretion systems,T4SS)是布鲁氏菌重要的毒力因子之一,它在布鲁氏菌感染的过程中可以将分泌蛋白转移到宿主细胞中,帮助其入侵和定殖,而这其中的机制还不完全清楚。本文主要研究T4SS分泌蛋白在布鲁氏菌感染过程中对细胞自噬和凋亡的影响。主要开展的研究工作如下:(1)构建流产布鲁氏菌2308(S2308)的VceA和VceC基因缺失突变株。分别扩增基因上下游同源臂和卡那基因,运用融合PCR融合三段基因并连接PMD18-T,同源重组的原理互换亲本株基因组中的目标基因,检测其生长特性,用两个缺失株分别侵染胚胎滋养层细胞(HPT-8)和感染小母鼠并检测其在胞内存活情况。结果显示成功构建缺失株ΔVceA和ΔVceC且稳定的传至少10代,生长趋势均在12 h达到对数生长期,30h进入平台期和亲本株无差异,在HPT-8细胞和小鼠脾脏中的存活能力显著低于亲本株S2308。(2)表达并纯化布鲁氏菌VceA和VceC蛋白,并分析其对细胞的影响。构建分泌蛋白VceA和VceC基因的原核表达载体,纯化后得到其重组蛋白。鉴定其反应原性,检测蛋白作用于细胞后细胞因子的表达量。结果显示成功构建VceA和VceC原核表达载体,纯化的蛋白Western blot检测出现杂交条带,具有很好的反应原性,VceA蛋白作用于细胞后TNF-α,IL-1β,TGF-β1的分泌量均显著升高,VceC作用的细胞IL-18,TNF-α和TGF-β1的分泌量显著降低。(3)初步探讨VceA和VceC基因对细胞自噬的影响。检测自噬相关基因ATG5,p62,LC3的m RNA表达量;Western blot,共聚焦显微镜和小鼠子宫免疫组化检测p62蛋白的表达量,透射电镜检测自噬小体。结果显示ΔVceA侵染细胞后p62基因的表达显著低于S2308组,ΔVceC感染小鼠1 d和7 d时均显著高于S2308组,VceC蛋白则无差异;ATG5的表达中ΔVceA在侵染细胞3h,24 h和感染小鼠1 d和56 d均显著高于S2308组,ΔVceC在侵染24 h和感染28d显著低于S2308,VceA蛋白则是3 h和12 h显著低于NC组,VceC蛋白无显著性差别;LC3-II/LC3-I的比值中ΔVceA在侵染细胞12 h,24 h和感染小鼠1 d,7 d时均显著高于S2308,而ΔVceC在侵染细胞后显著低于S2308组。WB实验显示ΔVceA组的p62蛋白在侵染细胞时无显著性变化,在小鼠子宫中显著低于S2308组,ΔVceC组比对照组高,VceA蛋白作用细胞后显著高于NC组;ΔVceA组ATG5蛋白的表达高于S2308组,ΔVceC侵染组显著低于对照组,而VceC蛋白作用组表达则高于正常组。激光共聚焦显示ΔVceA组低于S2308组,ΔVceC高于S2308组;小鼠子宫p62的免疫组化实验显示在1 d,7 d和14d时ΔVceA组可见的免疫染色少于S2308组,而ΔVceC则是多于S2308组;在电镜下ΔVceA侵染组中发现自噬小体。结果表明ΔVceA不同程度的促进细胞自噬的发生,VceA蛋白抑制细胞自噬;ΔVceC是不同程度的抑制细胞自噬的发生,VceC蛋白促进自噬。(4)初步探究VceA和VceC基因对细胞凋亡的影响。检测凋亡相关基因Caspase-3,Bcl-2,Bax的m RNA表达量;Western blot检测Caspase-3,Bcl-2和细胞内细胞色素C(Cyt-C)蛋白的表达量;流式细胞术检测HPT-8细胞的凋亡率;激光共聚焦显微镜和小鼠子宫免疫组化实验检测Cyt-C的释放情况。实验结果显示Caspase-3基因的m RNA的表达水平在侵染24 h时和小鼠感染后1 d时ΔVceA都显著低于S2308组;Bax/Bcl-2的结果显示侵染细胞3 h,24 h和感染小鼠7 d时ΔVceA均表现为小于1,ΔVceC在侵染24h和感染7 d,14d比值小于1,VceA蛋白作用组在12 h,24 h时表现为大于1,VceC蛋白只在24 h大于1;Caspase-3蛋白的表达和Cyt-C蛋白的表达及定位在24 h两缺失株都低于S2308组,而Bcl-2抗凋亡蛋白的表达中两缺失株均高于S2308组,两蛋白均低于对照组;细胞流式术检测中12 h只有ΔVceC低于S2308,24 h二缺失株均低于亲本株;小鼠子宫免疫组化显示两缺失株组出现的免疫染色少于对照组。结果表明ΔVceA和ΔVceC都是在不同程度上抑制细胞凋亡的发生,而VceA和VceC蛋白则是促进细胞凋亡的。
【图文】：

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鲁氏菌分泌蛋白 VceA和 VceC 对细胞自噬和凋亡的影响5图1 布鲁氏菌在巨噬细胞内存活的模式Figure .1 Working model of Brucella intracellular trafficking in macrophage cells2布鲁氏菌与细胞自噬2.1细胞自噬的概念自噬（autophagy）是在溶酶体国际会议上由科学家 Christian de Duve 第一次提出的[16]，是细胞完成自身代谢和某些细胞器更新的过程。它发生在真核生物的细胞质中，并且是非常保守的过程，并有许多自噬相关基因参与。首先形成的双层膜结构包裹需要被降解的底物（细胞自身蛋白质或细胞器等）成为自噬体(Autophagosome)，然后自噬体与溶酶体膜融合，需要降解的包裹物被溶酶体内的酶降解。这在调节细胞生命活动中具有重要作用[17]。细胞自噬功能的紊乱会导致许多疾病的发生，如神经退行性疾病、病原体感染和肿瘤发生等问题[18]。2.2细胞自噬的分类及发生由于细胞自噬过程中细胞内物质运送到溶酶体方式的差异，将其归为三种方式，即为：巨自噬（也叫大自噬，，macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediated atedautophagy

标准曲线,炎性细胞因子,标准曲线

A B图 1-1 炎性细胞因子标准曲线A：TNF-α标准曲线；B：IL-1β 标准曲线；Fig.1-1 The standard curve of Inflammatory cytokinesA: TNF-α standard curve. B: IL-1β standard curve.
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.61

【参考文献】