减蛋综合征病毒Hexon蛋白诱导鸭胚成纤维细胞凋亡的研究

发布时间：2020-02-05 21:13

【摘要】：减蛋综合征病毒(Egg drop syndrome virus,EDSV)来源于鸭,被命名为鸭腺病毒Ⅰ型,EDSV主要引起鸡的产蛋率及蛋品质的下降。近年来,研究表明EDSV可以导致雏鸭发生急性呼吸道感染,甚至出现死亡。目前,对人类感染腺病毒进行了广泛的研究,但是对于禽类感染EDSV的机制研究较少。在本研究中,EDSV及其Hexon蛋白均可以诱导鸭胚胎成纤维细胞(Duck embryonic fibroblast,DEF)发生细胞凋亡,从而为研究该病毒对禽类的致病机理提供相关的理论基础及科学依据。本试验结果如下:1.将EDSV接种DEF单层细胞后检测细胞病变效应(CPE)及病毒增殖水平。结果表明,EDSV感染DEF细胞均出现明显的细胞病变,随着感染时间延长,细胞界限不清楚,贴附性降低,细胞漂浮增多。利用实时荧光定量PCR方法检测EDSV在DEF细胞中的增殖规律表明:病毒水平在感染后24 h~60 h持续增殖。细胞培养上清液中的病毒血凝效价检测表明,随着感染时间的增加,病毒血凝效价从感染初期23上升至28。以上说明EDSV可以在DEF细胞上稳定持续的增殖并引起病变效应。2.利用流式细胞术研究EDSV诱导DEF细胞发生凋亡的结果表明,EDSV感染DEF细胞后24 h时凋亡率开始升高,在感染后60 h时凋亡率达到29.1%,差异显著(P0.05)。TUNEL检测发现凋亡阳性细胞数目在感染36 h~60 h时显著增加。利用Caspase活性实验以及Western blot法检测表明,EDSV感染能够激活Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9,并且上调细胞内Bax的表达,下调细胞内Bcl-2的表达,Bax/Bcl-2的比率随感染时间延长逐渐上升且差异显著(P0.05)。3.成功构建EDSV Hexon蛋白的真核载体pCDNA-3.1-Hexon,转染pCDNA-3.1-Hexon的DEF细胞在转染后24 h、36 h时Hexon的表达量较高,随后有所下降。利用TUNEL染色法发现,DEF转染pCDNA-3.1-Hexon后发生凋亡的阳性细胞的数目较对照组阳性细胞显著升高(P0.05),并且同组转染细胞在24 h、36 h时TUN EL阳性细胞数目较48 h、60 h时显著升高(P0.05)。Caspase活性和Western blot检测结果显示DEF细胞转染pCDNA-3.1-Hexon后,Caspase-8、Caspase-9及Caspase-3的活性在24 h、36 h时被激活。同时细胞内Bax的表达升高,Bcl-2的表达水平降低。本研究表明EDSV及其Hexon蛋白均可以诱导DEF细胞发生凋亡,且主要通过激活外源性途径和线粒体途径诱导的细胞凋亡,本研究结果为进一步探索EDSV感染对宿主细胞的致病机制提供理论依据,同时也为研究禽病病毒的致病机制提供新思路。
【图文】：

鸭胚,片段,基因扩增

图 2-1 感染 EDSV 后鸭胚原代成纤维细胞的病变观察(100×)Fig. 2-1 CPE of DEF cell after infected with EDSV (100×)2.3.3 penton 基因的 PCR 扩增通过普通 PCR 技术扩增 EDSV penton 片段，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。如图 2-2 所示，得到与预期片段大小相同的 151 bp 的特异性条带，，。M：DL2000 DNA 分子量 1：阴性对照 2：EDSV 五邻体基因扩增产物

增殖规律,细胞,随感

图 2-3 q-PCR 检测 EDSV 在 DEF 细胞上的增殖规律Fig. 2-3The proliferation of EDSV on DEF cell by q-PCR流式细胞术检测 EDSV 感染对 DEF 细胞凋亡率的影响图 2-4A、B 所示，与对照细胞相比，EDSV 感染 24 h 时 DEF 细胞<0.05），且凋亡率随感染时间增加；在感染后 60 h 时达到最大值（（P<0.01）。在对照细胞中没有观察到明显的凋亡率变化。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65

【参考文献】