胞内劳森菌PCR检测方法的建立及初步应用

发布时间：2020-02-17 04:26

【摘要】：为建立一种用于检测胞内劳森菌的检测方法,本试验根据GenBank中公布的胞内劳森菌16SrRNA设计引物建立PCR诊断方法。结果显示:获得了大小为481bp的PCR产物,核苷酸序列同源性分析结果均为99%以上;特异性试验表明该方法对大肠杆菌、沙门菌、志贺菌、猪流行性腹泻病毒和金黄色葡萄球菌均为扩增阴性;敏感性试验表明该方法的最低检出量为32.8μg/L;对20份临床样品阳性检出率为15%。结果表明:该方法具有较好的特异性和敏感性,适用于临床检测胞内劳森菌。
【图文】：

，验证该ＰＣＲ方法的特异性。１．７ＰＣＲ敏感性检测提取ＬＩ细胞培养物的ＤＮＡ，并采用紫外分光光度计测定其含量。按照１０倍倍比稀释法进行稀释，分别取１μＬ各稀释度ＤＮＡ模板进行ＰＣＲ，以检测该方法的敏感性。１．８应用性检测应用建立的ＰＣＲ方法对２０份疑似患有猪增生性肠炎的病猪粪便样品进行检测，，以证实该方法的临床实用性。２结果２．１ＰＣＲ扩增及序列测定ＰＣＲ扩增获得大约５００ｂｐ的特异性条带，与目的条带大小相近（图１）。图１ＬＩＰＣＲ扩增结果Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１．ＬＩ阳性样品；２．阴性对照将目的条带送往北京华大基因科技股份有限公司进行测序，获得大小为４８１ｂｐ的核苷酸序列。通过ＤＮＡＳＴＡＲ软件分析所得序列与ＧｅｎＢａｎｋ上发表的其他胞内劳森菌的１６ＳｒＲＮＡ序列的同源性，结果显示该序列与ＧｅｎＢａｎｋ上发表的其他胞内劳森菌的１６ＳｒＲＮＡ一致性均达到９９％以上（图２），证明所得片段为胞内劳森菌的１６ＳｒＲＮＡ序列。３７中国兽医学报２０１７年１月第３７卷第１期ＣｈｉｎＪＶｅｔＳｃｉＪａｎ．２０１７Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．１

图２同源性比较２．２ＰＣＲ特异性检测结果在最适的ＰＣＲ条件下，以ＬＩ阳性样品和其他对照样品基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ检测，结果只有ＬＩ阳性样品扩增出目的条带，结果见图３。图３ＰＣＲ特异性试验Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１．ＬＩ；２．大肠杆菌；３．沙门菌；４．志贺菌；５．猪流行性腹泻病毒；６．金黄色葡萄球菌２．３ＰＣＲ敏感性检测结果紫外分光光度计测得ＬＩ基因组ＤＮＡ的质量浓度为３２８ｍｇ／Ｌ。稀释质量浓度为３．２８×１０－４～３．２８×１０２ｍｇ／Ｌ。经ＰＣＲ检测，３．２８×１０－２～３．２８×１０２ｍｇ／Ｌ质量浓度的ＤＮＡ均有条带，该ＰＣＲ方法能检测到的最低胞内劳森菌的含量为３２．８μｇ／Ｌ（图４）。２．４应用性检测结果对疑似猪增生性肠炎的病料进行ＰＣＲ检测，２０份病料中共检测出３份阳性ＰＣＲ产物，经序列测定分析均为胞内劳森菌，检测率为１５％，表明该方法可用于临床检测猪增生性肠炎。３讨论猪增生性肠炎是由胞内劳森菌引起、在各种养殖条件下均可出现的全球性疾玻该病在很多国家和地区均有发现，美国、澳大利亚、英国、瑞典、丹麦、韩国、法国和我国等地都有相关病例的报道［５］。经图４ＰＣＲ敏感性试验Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１．３．２８×１０２ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；２．３．２８×１０ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；３．３．２８ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；４．３．２８×１０－１ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；５．３．２８×１０－２ｍｇ／Ｌ的ＬＩ；

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本文编号：2580317