Atg 5在TLR4介导蓖麻毒素损伤中的作用机制研究

发布时间：2020-02-24 22:17

【摘要】：蓖麻毒素(ricin toxin,RT)是大戟科蓖麻属植物——蓖麻(ricin)分离出的毒素蛋白。它由A、B两条链组成。其中,A链能够与真核细胞核糖体28S r RNA腺苷残基(A4324)高度特异性结合,发生脱嘌呤作用,形成次黄嘌呤-蓖麻毒素环(sarcin-ricin loop,SRL),抑制蛋白质合成,发挥毒性作用。蓖麻毒素能够引起细胞发生氧化应激和炎症反应,并进一步诱导细胞凋亡。而氧化应激和炎症的过程又会引起细胞自噬的发生。自噬是真核细胞高度保守的一种生存机制。它能够通过选择性或非选择性降解细胞蛋白、细胞器或病原微生物,并将降解后的产物再利用,从而起到保护细胞的作用。自噬的标志性物质是表面附有LC3蛋白的自噬体的形成。自噬体是一种双层膜结构,能够包裹及运输待降解物质的小囊泡,常在细胞受刺激后15-30min内即可被检测。自噬根据发生过程的不同又可分为三类,即大自噬、微自噬、分子伴侣介导自噬。“细胞自噬”通常都指大自噬。大自噬的发生过程包括诱导、形成、运输和融合、降解四个阶段。当细胞受到有害刺激,多种信号通路交互作用激活自噬信号通路,激活Beclin-1形成自噬泡即为诱导阶段。随后自噬相关蛋白LC3 I在Atg7的作用下向LC3 II转化,经Atg5-Atg12引导从而附着在自噬泡上。自噬泡延伸拓展,选择性或非选择性地将待降解物包裹形成自噬体,即为形成阶段。自噬体通过多种蛋白的协同定位作用可与吞噬体融,并最终与溶酶体进行融合,形成自噬溶酶体,即运输融合阶段。自噬溶酶体将待降解物通过酶促反应进行降解。随后自噬溶酶体裂解,并被其他细胞器再回收利用,完成降解阶段。Toll样受体属于模式识别受体,有13个家族成员,人类有10个(TLR1-10),而小鼠有12个(TLR1-9,TLR11-13)。根据接头蛋白的不同,可以将Toll样受体信号通路分为My D88信号通路和TRIF信号通路。TLR4的My D88信号通路是在TLR4被激活后,My D88与IRAK形成Myddosome复合体。随后IRAK1从My D88上分离,催化TRAF6发生聚泛素化。TRAF6与UBC13、UEV1A共同作用下,催化TAK1的聚泛素化,从而激活MAPK信号通路和NF-κB信号通路,诱导炎症因子的产生。而TLR4的IRAK信号通路需要TRAM进行受体蛋白分选,再经过TRIF自身低聚化而激活,使得TRAF6和TRAF3发生聚泛素化,并进一步募集IKKε和TBK1,引起IRF3磷酸化,最终引起I型IFN基因表达。Toll样受体信号通路与自噬信号通路之间存在交互作用。Toll样受体信号通路的活化能够诱导自噬的发生,而自噬又能通过激活酶活性或调控细胞因子分泌反馈性调控Toll样受体信号通路。已经证实TLR4的下游My D88、TRIF、TAK1等接头蛋白能与Beclin 1、Bcl-2共同调节自噬信号通路。Atg5作为巨自噬和微自噬的必要的基因标志,在自噬过程中起到重要作用。目前,对蓖麻毒素作用机制的研究主要围绕凋亡,未见自噬相关报道。本课题组前期研究发现蓖麻毒素能够激活巨噬细胞TLR4信号通路。本研究以探索Atg5在TLR4介导蓖麻毒素损伤中的作用机制为目的,以期为蓖麻毒素的功能开发及中毒救治提供新的参考思路。本课题包括以下方面:(1)蓖麻毒素诱导RAW 264.7细胞自噬的作用本课题测量了蓖麻毒素对RAW 264.7的IC50约为100 ng/m L,确定使用十分之一IC50即10 ng/m L的蓖麻毒素为自噬诱导剂量,并通过Western blot方法检测该剂量诱导不同时间细胞自噬的通量,最终确定蓖麻毒素诱导细胞自噬的条件:细胞密度2.5×105个/m L的RAW 264.7细胞,10 ng/m L蓖麻毒素诱导2 h。(2)蓖麻毒素对Atg5基因表达的影响通过用蓖麻毒素处理RAW 264.7,本课题通过PCR对Atg5蛋白进行检测。实验发现,经蓖麻毒素诱导后,Atg5表达量增高,变化规律与LC3正相关,2 h为峰值。(3)Atg5对蓖麻毒素激活TLR4信号通路的影响本课题通过将psi RNA-m Atg5质粒和psi RNA-Luc GL3对照质粒转染进入RAW 264.7,通过抗生素筛选,建立了Atg5基因沉默的RAW 264.7稳转细胞系和对照质粒稳转细胞系。经过PCR和Western blot验证,Atg5基因沉默的稳转细胞系Atg5的基因沉默率约为49.4%,蛋白沉默率约为89.7%。本课题通过Western blot对蓖麻毒素诱导RAW 264.7自噬后的TLR4信号通路TLR4、My D88、TRIF蛋白表达量进行检测,并与正常RAW 264.7细胞相比较。实验发现,经蓖麻毒素诱导后TLR4、My D88蛋白的表达量明显增高,TRIF蛋白的表达量变化不明显。这说明蓖麻毒素能够激活TLR4信号通路,并且激活TLR4信号通路下游My D88信号通路,而对TRIF信号通路无影响。基于Atg5基因沉默的RAW 264.7稳转细胞系,通过Western blot对Atg5基因沉默的RAW 264.7稳转细胞系的TLR4信号通路TLR4、My D88、TRIF蛋白表达量进行检测,并与正常RAW 264.7细胞相比较。实验发现,基因沉默Atg5后,TLR4、My D88、TRIF蛋白的表达量均提高。通过对Atg5基因沉默的RAW 264.7稳转细胞系经蓖麻毒素诱导自噬后,进行Western blot检测TLR4信号通路TLR4、My D88、TRIF蛋白表达量变化。发现此时的蛋白变化并无规律性。其中,TLR4蛋白略有降低而My D88、TRIF蛋白无明显变化。并且,同样用蓖麻毒素诱导自噬,Atg5基因沉默的细胞与正常细胞相比,在TLR4信号通路TLR4、My D88、TRIF蛋白表达量变化上也呈现出无规律性。其中TLR4和My D88蛋白略有降低而,TRIF蛋白则显著增高。鉴于已有文献报道自噬能够抑制炎症因子的产生及ROS的活性,综合考虑实验结果、自噬的作用及蓖麻毒素本身的毒理作用,对Atg5基因沉默经蓖麻毒素诱导自噬后TLR4相关蛋白表达的无规律性进行解释:Atg5能够反馈性抑制TLR4的活性。故基因敲除Atg5后TLR4相关蛋白表达均增高。当蓖麻毒素诱导细胞自噬后,TLR4相关蛋白的表达应该增高。而实验结果为TLR4蛋白略有降低而My D88、TRIF蛋白无明显变化。这可能是由于蓖麻毒素对蛋白质合成抑制起主导作用,而基因敲除Atg5对TLR4信号通路的活性增强作用更弱。该推论也能解释经蓖麻毒素诱导自噬的Atg5基因沉默细胞较经蓖麻毒素诱导自噬的正常细胞,TLR4和My D88表达量略有降低。但TRIF蛋白表达量明显增高,则可能存在其他信号通路对TRIF的表达进行影响,但仍需要进一步实验证明。本课题得出结论:(1)对于细胞密度2.5×105个/m L的RAW 264.7细胞,使用10 ng/m L蓖麻毒素诱导2 h,引起自噬通量最大,且存在剂量依赖性。(2)Atg5的表达与蓖麻毒素引起的自噬通量正相关。(3)Atg5能够通过抑制TLR4信号通路,抑制炎症反应。
【图文】：

蓖麻毒素,自噬,对照组,细胞

ern blot 结果如图 2 所示。Rapamycin 阳性组和 EBSS 阳性组 LC3 II于对照组，差异极显著。10 ng/mL RT 处理 RAW 264.7 细胞：1 h表达量已明显高于对照组，差异极显著；2 h 时，LC3 II 的表达量比对照组差异极显著；4 h 时，，LC3 II 的表达量降低，略高于对照。则对于细胞密度 2.5×105个/mL 的 RAW 264.7 细胞，10 ng/mL 起 LC3 增高最多，即自噬通量最大。

蓖麻毒素,表达水平,基因表达,细胞

264.7 经蓖麻毒素处理不同时间后 LC3 表达水平变化 Weste果使用正常 RAW264.7 细胞。EBSS 组用 EARLES BALANCED SALT Srapamycin 组用 rapamycin 处理细胞 2 小时。RT-1 h 组用 10 ng/mL h 组用 10 ng/mL 蓖麻毒素处理 2 h。RT-4 h 组用 10 ng/mL 蓖麻毒素平均数±标准误差。*表示与 Control 组比较 0.01<p<0.05；**表示与对 Atg5 基因表达的影响、RT 2 h 组、RT 4 h 组、对照组 Atg5 基因表达情况的 PC结果如图 3 所示。RAW 264.7 细胞经 10 ng/mL 蓖麻毒素
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S859.8

【相似文献】