J亚群禽白血病病毒表位疫苗候选抗原表位的筛选与鉴定

发布时间：2020-02-27 19:44

【摘要】：J亚群禽白血病是由反转录病毒科的J亚群禽白血病病毒(ALV-J)引起的主要以髓细胞过度增生的可传染的肿瘤性疾病,主要引起机体的生长抑制、免疫抑制以及多器官组织出现肿瘤。我国于1999年首次发现肉鸡感染此病毒后,发现其宿主范围不断扩大,不仅感染蛋鸡,而且向地方种鸡扩散;致瘤谱扩展、致瘤性明显增强,发病日龄提前,出现淋巴细胞瘤、血管瘤、纤维肉瘤、成红细胞瘤等多种肿瘤,给我国养禽业造成了极大的损失。鉴于病毒高度变异特性以及免疫逃避机制,传统弱毒疫苗、灭活疫苗尚不能提供有效的保护能力,国外对于此病的防控措施主要是通过种源净化的方式,不断淘汰感染阳性鸡群,取得了较好的效果,但养殖成本相对较高。而我国的养殖业水平相对较低,行业发展程度不高,难以完全通过净化的方式控制疾病的发生。目前,ALV-J在我国流行形势严峻,亟需开发有效的新型疫苗。表位疫苗是一种新型亚单位疫苗,越来越受到更广泛的关注和研究,其优势众多,可以克服传统疫苗造成的毒力恢复或散毒的可能。抗原表位肽短小但免疫原性更强,可以克服组织相容复合体的遗传限制。对于ALV-J这种高度变异的病毒,多表位疫苗含有广谱的表位信息,可以避免毒株的变异导致的免疫失败,从而提供更完全、更有针对性的免疫保护,为疾病的防控净化提供了条件。筛选和鉴定更多的抗原表位,不仅有助于了解病毒抗原结构,而且为表位疫苗的构建奠定了基础。本实验首先获得ALV-J病毒结构和抗原相关信息,采用预测法分析囊膜蛋白的抗原表位,筛选出代表近几年中国流行毒株的表位基因序列,采用编码甘氨酸、丝氨酸的密码子进行串联,基因片段cENV由生物公司合成后构建原核表达载体进行表达,选用不同表达载体对表达重组蛋白纯度进行优化选择,纯化后经SDS-PAGE鉴定和Western Blot分析,确定重组蛋白获得高效表达并且具有免疫原性后进行动物免疫实验。通过动物免疫实验验证获得的重组蛋白具有很强的免疫原性,并且刺激鸡体产生高效价的抗体,抗体维持时间接近14周。利用制备的高效价血清进行体外病毒中和实验,结果显示具有明显的病毒中和效果,达到40%-50%。对于高度变异的病毒,有必要进一步精确定位超变区的抗原表位,完善表位图谱,增强免疫保护效果。我们先将gp85片段分段进行原核表达,利用实验室制备的针对ALV-J gp85超变区的单抗2D5,对分段表达的抗原片段进行分析,初步确定抗原表位肽段区域,进一步设计合成小肽进行表位映射,精确定位了超变区hr1抗原表位序列为LRDFIAKWKSDDLLIRPYVNQS。经过表位氨基酸序列同源性比对分析,我们发现表位主要存在三个位点的氨基酸变异,变异氨基酸主要在于第六位氨基酸A变为E或T,针对氨基酸变异设计合成小肽分析氨基酸变异对表位抗原性的影响。确定此位点氨基酸变异是导致表位抗原性改变的关键氨基酸。利用临床采集的ALV-J阳性血清,进一步分析变异前后表位肽的免疫原性,结果显示不同表位肽均只与阳性血清反应,说明我们鉴定的表位肽具有良好的反应原性,也初步确定感染ALV-J的鸡群产生的抗体存在多种状态。本实验研究鉴定的抗原表位,丰富了ALV-J抗原图谱,为构建安全有效的多表位疫苗奠定了基础,为疾病的防控净化提供了条件。
【图文】：

片段,稀有密码子,生物工程,精氨酸

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重组质粒,山东农业大学,硕士学位论文,超声破碎

山东农业大学硕士学位论文在大肠杆菌中的诱导表达方法，将构建成功的表达菌 BL21-p 活化，待菌液活化至 OD600约为 0.8-1.0 时，加入达。预表达 3h 后收菌进行超声破碎提取蛋白，用E 分析。结果显示，两株表达菌均表达出目的蛋相符，并且主要以包涵体形式表达在沉淀中（个表达载体比较来看，pET-30a 表达蛋白明显纯，非常有利于蛋白的大量表纯化。对于大批量动以往经验，蛋白经过纯化后浓度会相应降低很很好的解决实验困难。我们确定选用 pET-30a 大
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4

【参考文献】