持续高浓度肾上腺素重编程大鼠原代胰岛细胞分泌功能

发布时间：2020-02-29 11:17

【摘要】：畜牧生产高度集约化,畜禽时常会处于非正常环境条件和非正常生理机能状态下,导致应激,从而限制畜禽生长发育,降低畜禽生产性能和免疫力,严重时引起死亡。已有研究表明,在应激状态下,机体应激激素处于持续的高水平,进而导致内分泌系统紊乱,能量代谢失衡。典型例子可见于热应激引发的胎羊在母体宫内发育迟缓,胎羊体内肾上腺素(Epinephrine,Epi)和去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)升高,且伴随胰岛β细胞分泌胰岛素的功能受损,进而对葡萄糖利用能力降低。进一步研究表明,对胎羊持续注射去甲肾上腺素同样会降低胰岛素分泌,而移除NE后,发现葡萄糖刺激下,胰岛β细胞分泌胰岛素出现代偿性增强。目前由应激引起的激素水平升高进而改变胰岛分泌功能的现象已普遍被认可,但仍缺少应激激素降低胰岛素分泌功能的直接性论证。因此,本研究以体外培养的大鼠原代胰岛细胞为试验材料,探究高浓度Epi对胰岛细胞分泌功能的作用。试验内容主要分为三部分:1、选取浓度为0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1μM、10μM的Epi,在20mM葡萄糖刺激下测定Epi对大鼠原代胰岛细胞分泌胰岛素的半抑制浓度(IC50),并将其作为后期试验的持续培养浓度。2、试验组:Epi(IC50)培养3天转移到普通培养液培养2天;对照组:在普通培养液中培养5天,选取浓度为0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1μM、10μM的Epi,在20 mM葡萄糖刺激下测定胰岛素分泌量(GSIS)及胰岛素总量。3、采用常规PCR与RT-PCR等技术手段测定葡萄糖刺激胰岛素分泌途径相关调控分子的表达。本试验结果:1、Epi对原代胰岛细胞分泌胰岛素的半抑制浓度为100 nM。2、胰岛素分泌量,试验组与对照组无显著差异,但从分泌曲线中可知,试验组对应的IC50是对照组的2.9倍(P0.05),显著升高;试验组胰岛素总量高于对照组42%(P0.05)。3、采用常规PCR验证GLUT2、肾上腺素受体、G蛋白亚基、Kir6.2、SUR1、CACNA1D、UCP2、PDX-1等调控信号分子在胰岛细胞内的表达模式,结果表明除α1A-AR,α1B-AR,β3-AR以及Gβ3以外的肾上腺素受体和G蛋白亚基均在胰岛细胞中表达;RT-PCR检测结果显示所有肾上腺素受体在胰岛细胞中表达无显著差异;而G蛋白亚基中Gs,Gz,Gβ1,Gβ2表达水平显著降低(P0.05),其他亚基无显著差异;此外,UCP2表达量显著下调(P0.05)。根据以上结果推测:1、持续高浓度肾上腺素抑制作用诱导肾上腺素受体脱敏,尽管相关肾上腺素受体的表达量未有显著变化,但试验组的Gβ1、Gβ2表达量下调推测肾上腺素受体发生磷酸化,受体对肾上腺素的敏感性降低,表明可能持续高浓度肾上腺素造成受体脱敏的原因可能是通过下调Gβ亚基表达下调肾上腺素受体敏感性,而不是通过减少受体数量。2、试验组的Gs表达量下调表明胞内cAMP浓度降低,说明持续肾上腺素抑制作用会通过降低G蛋白表达,抑制胰岛素分泌。3、试验组的UCP2表达量下调说明细胞内ATP合成增多,ATP/ADP比值升高进而诱导试验组的胰岛素分泌加强;但Gz下调表示其介导的胰岛素胞吐作用能力减弱,胰岛素颗粒分泌至胞外的含量减少,两者共同作用造成胞内胰岛素总量增加。综上所述,持续高浓度肾上腺素抑制会重编程大鼠原代胰岛细胞分泌功能,造成胰岛素总量增加,同时还能诱导肾上腺素受体脱敏。重编程胰岛功能的过程可能与UCP2介导调控胰岛素分泌途径及G蛋白亚基在胰岛素分泌途径中的功能相关。
【图文】：

路线图,试验技术,路线图

试验技术路线图

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入 Cold Quench Buffer 至 30 mL 离心洗涤备用。纯化的胰岛手挑置于盛有含 10%FBSRPMI1640 的 10cm培% CO2湿度培养箱中培养，培养 18 h 后将胰岛细胞转移至相应时间后，进行葡萄糖刺激胰岛素分泌试验。糖刺激胰岛素分泌分组置于 1.5 mL 冻存管中，每个管内 10 个胰岛细胞，3 个糖溶液与胰岛细胞 37℃共培养 1 h，收集上层液，用放射胞分泌量。细胞形态学观察腺经胶原酶消化、分离提纯后，，可获得分散较好的胰岛细胞察大鼠原代胰岛团呈圆形或椭圆形，淡黄色，边缘有完整光性。大小不一，直径在 50 ~ 250 μm之间，如图 3.1 所示
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.2

【参考文献】