略阳乌鸡ɑ干扰素原核表达载体构建及诱导条件优化

发布时间：2020-03-02 21:19

【摘要】：为了探索略阳乌鸡α干扰素在大肠杆菌中高效表达的诱导条件,试验采用PCR获得略阳乌鸡α干扰素成熟肽段的编码区DNA序列,将其克隆至载体p ET-32a的HindⅢ和XhoⅠ位点间,并通过菌落PCR和测序鉴定获得的鸡α干扰素的原核表达载体p ET-32a-Ch IFN-α。将p ET-32a-Ch IFN-α转化至大肠杆菌Rosetta菌株,通过筛选获得阳性克隆,进而分别对诱导表达时间、诱导剂浓度等条件进行筛选,获得了略阳乌鸡α干扰素的最佳表达条件。结果表明:成功构建p ET32aCh IFN-α质粒和重组菌株,最适诱导表达条件为诱导温度37℃,诱导剂IPTG浓度0.2 mmol/L,诱导时间5 h,诱导时机OD600值为0.448时。说明构建略阳乌鸡α干扰素的原核表达菌株成功,并且实现了α干扰素的高效表达。
【图文】：

不影响氨基酸组成，，表明成功构建了重组pET32a－ChIFN－α质粒。经CAI对其密码子分析，其中的一个突变在E．coliＲosetta中有利于鸡α干扰素表达。M．DL－2000Marker;1～3．基因组DNA。图1鸡的基因组DNA检测结果Fig．1DetectionresultofchickengenomicDNAM．DL－2000Marker;1．鸡α干扰素。图2鸡α干扰素亚克隆的扩增结果Fig．2IdentificationresultofChIFN－αsubcloningM．DL－2000Marker;1～9．阳性克隆菌落;白色箭头．目标蛋白。图3菌落PCＲFig．3ColonyPCＲ3．3重组菌株原核表达条件的优化及其检测结果3．3．1不同IPTG浓度对鸡α干扰素表达的影响SDS聚丙烯酰胺凝胶检测结果见图5，灰度分析结果见图6和图7。当加入IPTG后，目标蛋白表达量迅速增加，IPTG的浓度对于目标蛋白的表达存在一定的影响，当IPTG浓度为0．2mmol/L时，目标蛋白含量最高，其相对表达含量为53387．0550;目标蛋白/总蛋白为0．2586，达到最高表达水平。因此认为0．2mmol/L为最佳IPTG诱导浓度。3．3．2不同诱导时机对鸡α干扰素的表达的影响注:下画线部分是突变位点。图4阳性克隆测序Fig．4SequencingresultsofpositiveclonesM．低分子质量蛋白标准;1．Ｒosetta未诱导;2．Ｒosetta诱导5h;3．Ｒosetta/pET32a未诱导;4．Ｒosetta/pET32a诱导5h;5．Ｒosetta/pET32a－ChIFN－α未诱导;6～11．Ｒosetta/pET32a－ChIFN－α诱导5h(IPTG浓度为0．2，0．4，0．6，0．8，1．0，1．2mmol/L);白色箭头．目标蛋白。图5重组菌株Ｒosetta/pET32a－ChIFN－α在不同IPTG浓度诱导下的SDS－PAGE分析Fig．5SDS－PAGEanalysisofrecombinantＲosetta/pET32a－ChIFN－αinducedunderdifferentIPTGconcentrationsSDS聚丙烯酰胺凝胶检测结果见图8，灰度分析结果见图9和图10

不影响氨基酸组成，表明成功构建了重组pET32a－ChIFN－α质粒。经CAI对其密码子分析，其中的一个突变在E．coliＲosetta中有利于鸡α干扰素表达。M．DL－2000Marker;1～3．基因组DNA。图1鸡的基因组DNA检测结果Fig．1DetectionresultofchickengenomicDNAM．DL－2000Marker;1．鸡α干扰素。图2鸡α干扰素亚克隆的扩增结果Fig．2IdentificationresultofChIFN－αsubcloningM．DL－2000Marker;1～9．阳性克隆菌落;白色箭头．目标蛋白。图3菌落PCＲFig．3ColonyPCＲ3．3重组菌株原核表达条件的优化及其检测结果3．3．1不同IPTG浓度对鸡α干扰素表达的影响SDS聚丙烯酰胺凝胶检测结果见图5，灰度分析结果见图6和图7。当加入IPTG后，目标蛋白表达量迅速增加，IPTG的浓度对于目标蛋白的表达存在一定的影响，当IPTG浓度为0．2mmol/L时，目标蛋白含量最高，其相对表达含量为53387．0550;目标蛋白/总蛋白为0．2586，达到最高表达水平。因此认为0．2mmol/L为最佳IPTG诱导浓度。3．3．2不同诱导时机对鸡α干扰素的表达的影响注:下画线部分是突变位点。图4阳性克隆测序Fig．4SequencingresultsofpositiveclonesM．低分子质量蛋白标准;1．Ｒosetta未诱导;2．Ｒosetta诱导5h;3．Ｒosetta/pET32a未诱导;4．Ｒosetta/pET32a诱导5h;5．Ｒosetta/pET32a－ChIFN－α未诱导;6～11．Ｒosetta/pET32a－ChIFN－α诱导5h(IPTG浓度为0．2，0．4，0．6，0．8，1．0，1．2mmol/L);白色箭头．目标蛋白。图5重组菌株Ｒosetta/pET32a－ChIFN－α在不同IPTG浓度诱导下的SDS－PAGE分析Fig．5SDS－PAGEanalysisofrecombinantＲosetta/pET32a－ChIFN－αinducedunderdifferentIPTGconcentrationsSDS聚丙烯酰胺凝胶检测结果见图8，灰度分析结果见图9和图10

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本文编号：2584410