山羊关节炎-脑炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

发布时间：2020-03-09 04:06

【摘要】：为建立检测山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)血清抗体的间接ELISA方法,采用PCR方法扩增山羊关节炎-脑炎病毒CA蛋白编码基因序列,然后克隆至原核表达载体pET-28a(+),诱导含有重组载体pET-28a(+)-CA的大肠杆菌BL21(DE3)表达重组蛋白rHis-CA。采用Ni柱亲和层析方法纯化重组蛋白rHisCA,并以纯化的rHis-CA为包被抗原建立检测山羊关节炎-脑炎血清抗体的间接ELISA方法。结果表明重组蛋白rHis-CA以包涵体形式表达,具有良好的反应原性。所建立的rHis-CA间接ELISA方法的最适抗原包被质量浓度和血清稀释度分别为0.4 μg/mL和1∶100,血清阴阳性的D_(450)临界值为0.45。该方法仅与山羊关节炎-脑炎病毒阳性血清发生特异性反应,不与山羊痘病毒、蓝舌病病毒和口蹄疫病毒阳性血清发生交叉反应。对来自陕西地区的48份山羊血清进行CAEV抗体检测,rHis-CA ELISA和琼脂凝胶免疫扩散试验的阳性检出率分别为35.41%(17/48)和31.25%(15/48)。对来自天津地区2个山羊场的240份山羊血清样本进行CAEV抗体检测,rHis-CA ELISA方法和琼脂凝胶免疫扩散试验的检测结果均为阴性。
【图文】：

的敏感性。1.6.4重复性试验取1块rHis-CA抗原包被的ELISA板，按优化的rHis-CA间接ELISA方法同时检测6份山羊血清样品，每份血清做3个重复，计算同批次组内的变异系数。另取3块不同批次的rHis-CA抗原包被的ELISA板，，同法检测6份山羊血清样品，每份血清做3个重复，计算不同批次间的变异系数。1.7临床血清样本检测采用优化的rHis-CA间接ELISA方法对288份山羊血清样本中的CAEV抗体进行检测，同时与琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）的检测结果做比较。2结果2.1重组表达载体的鉴定重组质粒pET-28（＋）-CA的鉴定结果（见图1）显示，用特异性引物和通用引物对重组质粒pET-28（＋）-CA进行PCR鉴定，分别扩增出706和893bp的预期片段，用BamHⅠ＋XhoⅠ双酶切重组质粒pET-28（＋）-CA得到709bp的目的片段，表明插入载体的CA基因片段大小与预期结果一致。序列测定结果进一步证实插入载体的CA基因片段序列正确，无移码和突变现象发生。2.2重组蛋白的诱导表达和纯化重组蛋白rHis-CA的表达和纯化结果见图2。由图2可见，在诱导后菌体和超声后菌体沉淀中均有1条预期大小的特异蛋白条带，表明该重组蛋白是以包涵体的形式表达。随后，采用包涵体溶解及Ni柱亲和层析纯化方法获得了较高纯度的重组蛋白rHis-CA。2.3重组蛋白抗原性的鉴定用CAEV阳性山羊血清对纯化的rHis-CA蛋白进行Western-blot检测，结果显示有预期的目的反应条带出现（见图3），表明该重组蛋白具有与CAEV阳性血清反应的抗原性。2.4rHis-CAELISA检测方法的建立2.4.1最适抗原包被浓度和血清稀释度的确定试验结果见表1，当阳性血清D450在1.00左右时，综合考虑阴阳性血清的D值比值（P/N）和血清稀释度，确定His-CA重组蛋白的包被质量浓度为0.4g/mL，血清稀释度为1∶

onenzymedigestionidentificationoftherecombinantplasmidpET-28a（+）-CAM：DNA分子质量标准；1：pET-28a（＋）-CA的酶切产物；2：pET-28a（＋）-CA的通用引物PCR产物；3：pET-28a（＋）-CA的特异性扩增引物PCR产物；4：阴性对照M：DL2000plusDNAMarker；1：RestrictionenzymedigestionproductsfrompET-28a（＋）-CA；2：PCRproductofpET-28a（＋）-CAbyuniversalprimers；3：PCRproductofpET-28a（＋）-CAbyspecificprimers；4：NegativecontrolM12345000bp3000bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图2His-CA重组蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2SDS-PAGEanalysisofrHis-CAfusionproteinM：蛋白质分子质量标准；1、2：rHis-CA蛋白的纯化产物；3：pET-28a（＋）-CA菌裂解上清；4：pET-28a（＋）-CA菌裂解沉淀；5：诱导4h后pET-28a（＋）-CA全菌蛋白；6：pET-28a（＋）-CA未诱导产物M：ProteinmolecularweightMarker；1，2：PurifiedrHis-CAprotein；3：SupernatantsofpET-28a（＋）-CAbacteriallysates；4：PrecipitatesfrompET-28a（＋）-CAbacteriallysates；5：RecombinantproteinrHis-CAinducedwithIPTGfor4h；6：RecombinantproteinfrompET-28a（＋）-CAwithoutinduction12M3456116.0ku66.2ku45.0ku35.0ku25.0ku18.4ku28ku565

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