下调Dlg1对猪卵母细胞体外发育的影响

发布时间：2020-03-09 06:36

【摘要】：哺乳动物肿瘤抑制基因Discs large homologue1(Dlg1),是膜相关鸟苷酸激酶((m embrane-associated guanylate kinase,MAGUK)家族的一员,通过PDZ区与其他分子相互作用参与微管极化,,心体再定向以及细胞迁移。Dlgl突变时,会出现微丝和微管的异常组装而导致的细胞极性异常,如:柱状上皮细胞去极化和细胞粘附分子的异常分布(吕鸿2010)。小鼠卵母细胞减数分裂过程中Dlgl表现为极性分布,并且这种极性分布与细胞骨架微丝微管之间存在着密切关系。本研究以猪卵母细胞为材料,旨在观察Dlg1在猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育进程中的表达定位,并在此基础上通过RNA干扰技术,引入外源性si RNA,进一步研究Dlgl在这两个发育过程中的作用。试验结果如下:1、通过QRT-PCR检测了猪多种组织细胞中Dlg1的mRNA表达水平。结果发现卵巢组织和肺组织中Dlg1的表达量最高,PEF中表达量最低。2、免疫荧光染色检测猪卵母细胞和早期胚胎中Dlg1的蛋白表达和分布。发现,在GV期猪卵母细胞中,Dlg1在整个胞质和细胞核均匀分布,从GVBD~PreMⅠ开始到MⅡ胞质中Dlg1逐渐向中心聚集,蛋白颗粒更明显,皮质处的分布明显减少;孤雌激活后的早期胚胎中,Dlg1在整个胞质弥散分布,但表达量逐渐下降2cell、4cell、囊胚期分别只有MⅡ期的46.9%、58.4%、29.66%。3、通过QRT-PCR和免疫荧光染色方法来筛选Dlg1的有效siRNA序列,结果显示siRNA-2干扰效率最高,可分别在mRNA和蛋白水平上下调Dlg1表达的82.1%和61.28%。4、通过显微注射的方法将Dlg1 siRNA-2注射到GV期的猪卵母细胞胞浆和孤雌激活后2h的胚胎中。结果显示:siRNA-2注射组的第一极体排出率为25.2%±3.3%,与对照组(73.4%±4.7%)相比显著下降,说明下调Dlg1能显抑制猪卵母细胞体外成熟。而且,免疫荧光染色发现下调Dlg1后影响体减数第一次分裂过程中微管装配及纺锤体的形成;siRNA-2注射组的卵裂率和囊胚率分别为73.3%±0.7%和19.8%±1.8%,与对照组相比(76.9%±2.1%;22.9%±1.35)差异不显著,说明下调Dlg1不影响猪早期胚胎的卵裂率和囊胚率。
【图文】：

小鼠卵母细胞,减数分裂

第一章哺乳动物卵母细胞不对称性的主要分子基础哺乳动物卵母细胞减数分裂包含两轮连续的不对称分裂，形成一个大的全能的单体卵和两个小的极体，，这种不对称分裂是由后期开始之前卵母细胞内不对称分裂的发和发展决定的，包括不对称的纺锤体定位、皮质分化这两个关键的细胞内事件。体外熟时，生发泡破裂（Germinal Vesicle Breakdown，GVBD）之后，减数第一次分裂的锤体在细胞中心形成，染色体排列之后染色体—纺锤体复合物立刻沿着纺锤体长轴朝皮质一侧起始迁移。伴随这个过程的是将在皮质定位的染色体诱导的一系列皮质重包括以肌球蛋白环围绕富含肌动蛋白（Actin）的功能域为特点的 Actin cap 和皮质颗游离结构域的建立、膜微绒毛的消失以及相关分子的极性累积。纺锤体迁移、定位和质重组是卵母细胞不对称分裂的基础和关键。到了后期，富含 Actin 的功能域凸出，球蛋白环收缩导致含有一套同源染色体的第一极体（Polar Body 1，PB1）排出，PB出之后，卵母细胞进入第二次减数分裂并前进到中期（MⅡ），纺锤体在皮质下方第次分裂的区域重新装配，皮质的肌动球蛋白域在纺锤体上方与 MⅠ相似的位置建立。在，卵母细胞完全成熟并阻滞在这个时期等待受精（图 1-1）。

小鼠卵母细胞,染色体,对称性,皮质

鼠卵母细胞两阶段染色体迁移和对称性破坏(Yi et alchromosome migration and aymmertry breaking in m皮质极化发出皮质极性建立的信号（Cap）是对极体排出必需的结构。当减数第阻滞期间纺锤体不对称地定位在皮质下方时 C86)。先前的研究表明，Cap 结构的建立依赖于染每一个染色体团分散，皮质同样诱导形成 A有染色质）或者精子染色质注射进 MⅡ卵胞质003, Deng et al. 2007)，说明染色质诱导的皮质色体或者 DNA 刺激皮质结构域的形成与皮质是在一个 20-25um 的距离内，并且诱导皮质结皮质极性的‘远距离’效应与在 Ran 鸟苷三磷成的诱导类似，通过空间上分别行动的 Ran 鸟
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S828

【参考文献】