2018-2019年陕西省屠宰生猪中猪瘟病毒和猪圆环病毒2型检测与基因分析

发布时间：2020-03-18 11:54

【摘要】：猪瘟(Classical swine fever,CSF)和猪圆环病毒病(Porcine circovirus diseases,PCVDs)是影响养猪业的重要传染病,其病原分别为猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)。在疫苗免疫压力下CSFV和PCV2感染猪的临床表现呈现多种变化,有些感染带毒猪并不表现临床症状,成为重要的传染源;另外,病毒的变异也可能是疫苗免疫猪再次感染的重要原因。建立敏感特异的检测方法,可以快速检测发现CSFV和PCV2带毒猪,及时处理。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型的核酸检测技术,对病毒核酸检测具有敏感、特异、操作简便的优点,在病毒检测方面的应用研究广泛。临床健康的屠宰生猪也可能存在携带CSFV和PCV2的情况,通过检测两种病原的携带率,对检测到病毒进行遗传变异分析,可以为养殖场对CSFV和PCV2的防控提供基础资料。本研究首先建立了检测CSFV和PCV2的LAMP方法,从陕西省规模化生猪屠宰企业采集样品,进行CSFV和PCV2的核酸检测;对检测为阳性的样品进行病毒基因扩增和序列分析、病毒的分离鉴定。本研究取得以下结果:(1)建立了检测猪瘟病毒的RT-LAMP方法和猪圆环病毒2型的LAMP方法。建立的方法具有较高的敏感性。猪瘟病毒RT-LAMP方法对病毒RNA最低检测限为2.58×10~(-7) ng/μL,猪圆环病毒2型LAMP方法对病毒DNA的最低检测限为9.7×10~(-5)ng/μL;而常规PCR方法最低检测限分别为2.58×10~(-6) ng/μL和9.7×10~(-4) ng/μL。(2)对2018-2019年陕西省屠宰生猪猪瘟病毒和猪圆环病毒2型进行了检测。2018-2019年,从陕西省采集了来自7个地区屠宰生猪样品300份,用建立的CSFV和PCV2 LAMP方法进行检测。结果显示,CSFV阳性样品有30份,阳性率为10.0%(30/300);PCV2阳性样品43份,阳性率14.3%(43/300)。应用常规RT-PCR(PCR)的检测结果为CSFV阳性样品21份,阳性率7.0%(21/300);PCV2阳性样品38份,阳性率12.7%(38/300)。(3)对猪瘟病毒和猪圆环病毒2型进行了基因分析和分型。30份CSFV检测阳性样品中的12份样品克隆获得了E2基因全长片段,基因分析显示2株CSFV属于1.1亚型的石门系强毒株,10株属于1.1亚型猪瘟兔化弱毒疫苗株,说明目前陕西省猪群中的CSFV还是以1.1亚型为主。43份PCV2阳性样品中的20份样品克隆获得了PCV2 Cap基因全长片段,基因分析显示,有11株属于PCV2b亚型,9株属于PCV2d亚型,说明目前陕西省猪群中的PCV2以2b和2d亚型为主。(4)获得了猪圆环病毒2型分离株。从43份PCV2核酸阳性样品中分离获得了2个PCV2分离株,均为PCV2b亚型,分别命名为PCV2/SX-BJ/2019和PCV2/SX-YL/2019,分离毒在感染PK-15细胞中的滴度分别为10~(-5.5994)TCID_(50)/100μL和10~(-4.7096)TCID_(50)/100μL。
【图文】：

mmol/L;3.dNTPs concentration 0.6 mmol/L;4.dNTPs concentration 0.8 mmol/L;M.DNAMarkerDL2000.图2-2 猪圆环病毒2型LAMP反应体系确立Fig.2-2 Establishment of Porcine circovirus type 2 LAMP reaction system

第二章 猪瘟病毒和猪圆环病毒 2 型 L MP 检测方法的建立及应用的电泳鉴定和可视化观察 RT-LAMP 检测反应产物的观察 CSFV RT-LAMP 反应体系，反应后的产物进行电泳检测暂离心后，阳性管底部有白色沉淀，阴性管底无白色沉淀YBRGreenⅠ核酸染料，观察到阳性样品呈现绿色，阴性样管置于紫外灯下观察，阳性样品管有明显的荧光，阴性。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S851.43

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本文编号：2588676