伪狂犬病毒变异株的分离鉴定

发布时间：2020-03-18 11:42

【摘要】：伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)引起的一种高度致死性急性传染病,多种家畜和野生动物均易感,主要特征为发热、奇痒(猪除外)及繁殖障碍。被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病,我国也将其列为II类动物疫病。自从2011年以来,我国多个已经免疫了PRV gE基因缺失疫苗猪场的猪群出现了类似PR的症状,给养殖户带来了巨大的经济损失。2016年11月,吉林省长春市双阳区某小型猪场,母猪出现流产和产死胎的现象,母猪无死亡病例。仔猪出现腹泻、呕吐、体温升高、精神不振、食欲减退以及轻微的神经症状,新生仔猪发病率极高,死亡率达100%,该场从未接种过PRV疫苗。根据流行特点和临床症状,初步判定为猪伪狂犬病、猪圆环病毒病和猪细小病毒病。为了验证猜想,本研究通过流行病学调查、病理组织学观察、PCR及RT-PCR技术、细菌学检查、电镜观察、动物回归实验、间接免疫荧光试验等方法从病理学和病原学两个角度对该病进行了分析和研究。1、病理学诊断对送检病猪进行常规病理剖检,剖检发现,送检病猪的各组织脏器均有不同程度的病理变化:心脏衰竭,左侧心脏较右侧更为明显;肺脏充血水肿;肠系膜淋巴结肿大,小肠出现树枝状出血;肝脏和脾脏上均出现大量针尖状灰白色坏死点和坏死灶,此病理变化为猪伪狂犬病的特征性病变。随后制作石蜡切片,镜检发现,肝脏、脾脏均发生局灶性坏死。肝脏坏死灶内有炎性细胞的聚集,坏死灶周围肝窦内有红细胞的淤积;脾脏坏死灶形态不规则,中心区域结构不清楚,鞘动脉周围淋巴细胞坏死。这与猪伪狂犬病的特征性病理变化相吻合。2、病原学诊断研磨病料提取DNA,设计针对PRV的特异性引物进行PCR扩增,扩增出了与目的大小一致的片段。随后设计针对猪细小病毒病和猪圆环病毒病的特异性引物进行鉴别诊断,PCR及RT-PCR的特异性扩增结果均为阴性,排除了猪细小病毒病和猪圆环病毒病的可能性。通过触片染色方法进行细菌学检查,排除了细菌感染的可能性。将感作好的加有双抗的病料上清液接种BHK-21细胞进行病毒的分离,接种后72h并没有出现细胞病变(cytopathic effect,CPE),随后我们进行了盲传,当盲传至第8代时,细胞出现了变圆、折光率增强以及合胞体等典型的CPE现象。此时收集细胞病变液,进行电镜观察。利用Muench法测TCID_(50),得出该分离毒株的感染滴度为10~(-5.4)/0.1 mL。将细胞病变液反复冻融3次,离心取上清接种家兔,3d出现亢奋、奇痒以及轻度的神经症状,皮肤抓咬破溃,6d内全部死亡。对兔组织进行PCR鉴定,扩增了与出目的大小一致的条带。剖检可见脑膜充血,有大量的脑脊髓液;心脏充血,心包内有大量积液;肺脏充血水肿。其他脏器并无明显的病理变化。镜检,肺脏有炎性细胞浸润,肺泡壁毛细血管充血;心肌变性,间质增宽,有大量炎性细胞浸润;脾脏淋巴滤泡体积缩小,红髓间质增宽,局部红髓间质内可见较多的成纤维细胞。通过对PRV感染细胞和攻毒兔进行IFA鉴定发现,接种病毒的BHK-21细胞胞浆及胞核内和攻毒兔脑组织内均有红色荧光的出现,这进一步证实了所分离毒株为猪伪狂犬病毒。分离出PRV后对分离株gE基因进行克隆测序,并进行变异性分析、同源性分析以及进化树分析。通过变异性分析,确定该分离株为变异毒株;通过同源性分析,发现分离株与河南的变异株HeN1株gE基因核苷酸及编码的氨基酸同源性最高,分别达99.9%和99.8%;通过进化树分析得出,gE基因主要分为两个大分支,本分离株与河南的变异株HeN1株亲缘关系最近。本研究丰富了PRV变异株的遗传进化规律,为研究和防控猪伪狂犬病打下了坚实的基础。
【图文】：

局灶性坏死,脾脏,针尖,灰白色

.2.3 病理组织学观察镜检，肝脏局灶性坏死，坏死灶内有炎性细胞聚集，坏死灶周围肝窦内有胞淤积（图 2.2）。脾脏局灶性坏死，坏死灶形态不规则，，中心区域结构不清动脉周围淋巴细胞坏死（图 2.3）。图 2.1 送检猪主要眼观病理特征（A）肝脏针尖状灰白色坏死灶（B）脾脏针尖状灰白色坏死灶（C）肺脏水肿（D）肠系膜淋巴结肿大，小肠树枝状充血Fig 2.1 The main pathological characteristics in pigs(A) Liver needle-like gray necrosis (B) Spleen needle-like gray necrosis (C) Pulmonary edema(D) Mesenteric lymph nodes, small intestine dendritic hyperemia

局灶性坏死,肝脏

2.2.4 病原学检查2.2.4.1 细菌学检查结果经革兰氏染色后发现，肝脏、脾脏、肺脏、肾脏的触片以及培养物中均未检测出细菌。2.2.4.2 PCR 检测结果利用上述设计的针对 PRV 的特异性引物进行 PCR 扩增，扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后置于凝胶成像仪中观察结果，可见扩增出与 PRV 预期大小一致的特异性条带，长度为 494bp，如图 2.4。图 2.2 肝脏局灶性坏死(H&E, 400×) 图 2.3 脾脏局灶性坏死(H&E, 100×)Fig. 2.2 Focal necrosis of the liver(H&E, 400×) Fig 2.3 Focal necrosis of the spleen(H&E, 100×)
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】