基于量子点标记检测狂犬病病毒G蛋白含量的荧光免疫吸附法的建立

发布时间：2020-03-18 11:15

【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种感染几乎所有温血动物的中枢神经系统的人兽共患病,是至今为止人类病死率最高的急性传染病之一。狂犬病到目前为止仍没有特效治疗药物出现,现如今只能在被患病动物咬伤之后尽快暴露后免疫来预防狂犬病的感染。其中狂犬病病毒G蛋白是唯一一个诱导机体产生中和抗体的蛋白,在一定程度上可以认为疫苗中G蛋白的含量可以决定疫苗的保护效力。因此建立快速检测狂犬病病毒G蛋白含量的方法对于疫苗免疫效力的确定及免疫剂量的确定十分重要。酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一种广泛使用的免疫学检测方法,但是传统的ELISA仍具有灵敏度相对不足,检测成本高等缺点。而量子点以其优良的光谱特征和光化学稳定性在生命科学尤其是体外诊断中的应用越来越广泛,其中与ELISA结合的方法可以大大提高传统方法的灵敏度。本研究以ELISA作为基本分析方法,以狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体作为捕获抗体,以量子点标记的糖蛋白单克隆抗体作为检测抗体,建立荧光免疫吸附法(Fluorescence-linked immunosorbent assay,FLISA)来检测狂犬病病毒G蛋白含量,对于疫苗抗原含量的效价和免疫剂量的确定具有重要意义。1.狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体的制备与鉴定本研究成功获得3株抗狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体,分别命名为9F10,1F1和9G10。并对这3株抗体的特性进行鉴定,这3株单克隆抗体均为IgG类抗体,其中9F10和1F1为IgG_(2b),9G10为IgG_(2a),而轻链均为kappa。染色体检测结果9F10的染色体数目为90,1F1的染色体数目为89,9G10染色体数目为97。在间接免疫荧光实验中3株单克隆抗体均能特异性识别实验室狂犬病病毒固定毒株SAD、B2c,狂犬病病毒犬源野毒株DRV-Mexico、DRV-HuNPN01,DRV-AH08以及蝙蝠源野毒株SHBRV。在Western blot实验中,1F1、9F10和9G10均只能识别SAD。在抗原表位鉴定的Western blot实验中,结果显示9G10的抗原位点在239-339 aa之间,9F10与1F1的抗原位点在1-139 aa之间。2.狂犬病病毒G蛋白量子点荧光免疫吸附法FLISA检测方法的建立通过量子点偶联抗体前后表征实验,结果表明量子点偶联抗体之后能够正常的激发荧光,且荧光波长没有发生改变,凝胶电泳实验表明量子点已经成功修饰在抗体上。通过配对试验确定以9F10为捕获抗体,包被浓度为2μg/mL,以9G10与ZnCdSe/ZnS量子点偶联量子点并作为检测抗体,稀释度为1:200。用以上包被浓度和抗体稀释度进行反应条件优化。结果最优封闭液为0.5%BSA+0.05%Tween-20磷酸盐缓冲液,封闭时间为1 h,样品稀释液为1%BSA+0.05%Tween-20磷酸盐缓冲液,样品孵育时间为2 h,量子点偶联抗体孵育时间为1 h。灵敏性实验表明FLISA最低检测限度为1:1600稀释度,而传统双抗夹心ELISA为1:400稀释度。以梯度稀释的样品进行检测,构建了用于定量检测的标准曲线y=0.6176x+7559.5,R~2为0.9719。特异性实验表明,该方法不会与犬瘟热病毒,犬细小病毒以及293T细胞和BSR细胞产生非特异性反应。本研究成功获得3株特异性好的抗狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体,并以此为基础偶联量子点建立荧光免疫吸附法用于检测狂犬病病毒G蛋白的含量,为今后狂犬病疫苗的效价评估提供一种快速、灵敏的检测方法。
【图文】：

检测狂犬病病毒 G 蛋白含量的荧光免疫吸附对伤口进行清洗，接种疫苗，然物学包膜传染性粒子，大小为 180 nm 1-1(Fooks and Cliquet 2017)。病螺旋状核衣壳形成的致密圆柱体穗状突起的外周囊膜，是病毒的外的不分节段的单股负链 RNA 基因组，其顺序高度保守，从基因组的 5组编码的五种蛋白质分别是核蛋白赖性 RNA 聚合酶蛋白(L)。

图 1-2 量子点与抗体之间的非共价结合(Xing et al 2007)A：Ni-NTA 修饰的 QD 与组氨酸标记的肽或抗体的结合B：链霉抗生物素蛋白的 QD 与生物素化抗体的非共价合Fig. 1-2 Noncovalent binding of quantum dots to antibodies(Xing et al 2007)A: Binding of Ni-NTA-modified QD and histidine labeled peptides/antibodiesoncovalent binding of streptomyces anti-biotin protein QD and biotinylated antibody价偶联抗体的共价偶联最常用的结合方式是使用 1-乙基-3-［3-二甲基氨基丙酸化物(Ethyl -3- [3- dimethyl aminopropyl] carbonized diimine hydroc联剂将抗体和量子点直接偶联在一起。该方法的最大优点在于大部分的氨基和羧基，在进行量子点偶联之前不需要对抗体进行化学修饰，体的氨基与量子点的羧基的结合是随机的，如图 1-3(Xing and Chaudry 应中可能会出现一种情况：抗体的抗原结合位点被结合在抗体附近的
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

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本文编号：2588645