反10、顺12共轭亚油酸（Trans10,Cis12-CLA）对奶山羊乳腺上皮细胞脂代谢的调控作用研究

发布时间：2020-03-18 10:06

【摘要】：山羊奶富含短、中链脂肪酸以及多种不饱和脂肪酸。乳中短、中链脂肪酸(C8-C14)和部分长链脂肪酸(C16)主要由乳腺上皮细胞从头合成,而长链脂肪酸(C16及以上)主要通过外源吸收获得。反10、顺12共轭亚油酸(t10c12-CLA)是反刍动物瘤胃微生物代谢的中间产物,在碳链第10位和第12位形成共轭双键的十八碳烯酸,具有降低乳脂合成的作用,可抑制山羊乳腺短、中链脂肪酸的合成,然而目前t10c12-CLA调控脂肪酸的分子机制尚不明确。通过研究t10c12-CLA调控山羊乳腺上皮细胞脂代谢分子机理,对调控羊奶中脂肪酸成分和含量,改善羊奶风味以及提高羊奶品质具有重要的理论意义和实用价值。本研究通过日粮添加t10c12-CLA饲喂泌乳期西农萨能奶山羊,构建体外乳腺上皮细胞t10c12-CLA处理模型,结合转录组测序技术,细胞功能和形态学研究,基因表达和蛋白表达水平的检测,基因转录调控机制的探索,以及细胞信号转导的研究手段,探究了t10c12-CLA对山羊乳脂代谢的影响及分子调控机制,获得如下结果:1.t10c12-CLA对奶山羊泌乳性能的影响选择30只西农萨能奶山羊经产母羊,按体重和产奶量分为3组,每组10只。分别饲喂0、8 g/d(CLA-1组)和16 g/d(CLA-2组)的脂包被的共轭亚油酸(LE-CLA),结果表明,试验组与对照组相比产奶量、乳糖和乳蛋白变化不显著(P0.05);乳脂肪含量显著降低(P0.05)。两个试验组中短中链脂肪酸(C16)含量均显著下降,且CLA-1和CLA-2组差异显著(P0.05);C16:0和C16:1含量在CLA-2组中显著下降(P0.05),而长链脂肪酸(C16)在各组间差异均不显著(P0.05)。饱和脂肪酸(SFA)和不饱和脂肪酸(UFA)含量分别随着CLA饲喂浓度的增加而显著降低和升高(P0.01)。CLA-2组C16和C18去饱和指数显著高于对照组(P0.01)。2.t10c12-CLA对山羊乳腺上皮细胞(GMECs)生长的影响对体外培养的GMECs外源添加不同浓度的t10c12-CLA,通过细胞活力、hoechst33342染色、实时定量PCR(RT-qPCR)、western blot以及细胞划痕试验发现,100μM浓度的t10c12-CLA处理GMECs后细胞增殖未受到影响,没有发现明显的细胞凋亡,但对细胞迁移表现出抑制作用。200μM浓度的t10c12-CLA处理GMECs不超过12 h时对细胞增殖未造成影响,但超过12 h时可明显抑制细胞增殖。3.t10c12-CLA处理GMECs的转录组测序(RNA-seq)与生物信息学分析对体外培养的GMECs外源添加0、100μM和200μM浓度t10c12-CLA(分别命名为CTR、TR1和TR2组),提取细胞总RNA并进行RNA-seq分析。使用山羊基因组(Capra hircus genome,ID:10731)作为参考基因组,注释到转录本一共25153条,以RPKM0.01作为基因表达的标准,CTR、TR1和TR2组分别有17559、17455和17982个基因表达。以校正后的P值0.05作为差异基因的阈值,TR1 vs.CTR,TR2 vs.CTR和TR1vs.TR2分别有49、854和623个差异基因。通过对差异基因组共有的41个差异基因进行GO和KEGG显著性富集分析发现,所富集到的细胞信号通路大多数与脂代谢相关。通过RT-qPCR验证测序结果可靠,同时发现ACSL4、FDPS、HMGCS1、PLIN2、SCD1和SLC2A1基因表达水平随着t10c12-CLA处理浓度增加而发生明显变化,呈现出显著的剂量依赖效应(P0.05)。4.t10c12-CLA影响GMECs脂代谢相关基因的表达及转录调控对体外培养的GMECs外源添加100μM浓度t10c12-CLA,通过油红O染色、细胞内脂肪酸成分测定、RT-qPCR、western blot、免疫荧光染色等技术手段研究发现,t10c12-CLA能够抑制脂肪酸从头合成和去饱和过程,而长链脂肪酸(LCFA)摄取和脂滴形成相关过程被激活,胞浆脂滴的积累增加。通过荧光素酶报告试验发现,t10c12-CLA抑制了SREBP1和SCD1基因的启动子活性;进一步发现SCD1基因启动子核心区域SRE位点活性也被t10c12-CLA抑制。5.t10c12-CLA通过AMPK和mTOR通路调控GMECs脂代谢的分子途径对体外培养的山羊乳腺上皮细胞外源添加100μM、200μM浓度t10c12-CLA研究发现,t10c12-CLA能够显著降低mTOR磷酸化水平,增加AMPK磷酸化水平。Akt/mTOR通路特异性抑制剂MK-2206和Rapamycin,以及AMPK通路抑制剂Dorsomorphin处理GMECs后,Akt/mTOR通路和AMPK通路分别受到影响;抑制剂和t10c12-CLA共同处理GMECs发现,t10c12-CLA可负调控Dorsomorphin对ACACA和SCD1基因表达的上调作用;Rapamycin和t10c12-CLA对SREBF1表达的抑制作用具有协同效应。综上所述,t10c12-CLA对奶山羊乳脂代谢具有重要的调控作用,不仅降低山羊乳脂率和短中链脂肪酸含量,而且抑制GMECs脂肪酸从头合成和去饱和化过程,并通过SREBP1调控SCD1基因的转录;同时通过影响AMPK和mTOR的激酶活性调控乳脂代谢网络。
【图文】：

出生后,动物,上皮,乳腺上皮细胞

图 1-1 动物出生后乳腺的发育（引自 Macias and Hinck, 2012）Figure 1-1 The stages of postnatal mammary gland development (Macias and Hinck, 2012)乳腺上皮中主要存在两种细胞类型：基质上皮和腔上皮。基质上皮由肌上皮细胞组成，形成腺体外层；腔上皮细胞形成导管和分泌腺泡。与肌上皮相结合，腔上皮生成两层状的管状上皮结构，在哺乳时外部肌上皮细胞收缩，将来自腺泡腔细胞的乳汁挤压出来(Macias and Hinck, 2012)。乳腺产奶量主要取决于以下几个因素：乳腺上皮细胞的数量、增殖、凋亡细胞比例的变化(Sordillo et al., 1984, Capuco et al., 2003)；上皮细胞的分泌能力和活力、细胞分化程度(Akers et al., 2006)；和乳腺血管运输营养物质的代谢能力、血管发生情况(Djonov et al., 2001)。不同泌乳时期能够影响乳腺细胞的数量和分泌活性。在泌乳盛期和中期，乳腺上皮细胞具有较强的分泌能力。对乳腺组织形态学观察表明，不同泌乳时期乳腺有着明显的差异，而且在泌乳初期和中期分化更加明显，具有最大的腺泡截面积；在泌乳初期到中期，乳腺上皮细胞增加 12%，泌乳量增加 51.3%；而在泌乳中期到后期，乳腺上皮细胞减少 35.9%，泌乳量下降 71.4% (Elsayed et al., 2009)。1.2 乳脂代谢的调控

信号通路,亚基,磷酸化

a2+信号和的钙调蛋白依赖型蛋白激酶（calmodulin-dependent protein K）调节，在这些细胞中 CaMKKβ 主要负责激活 Thr172(Hawley et al., 2005005)。β-亚基的主要功能是作为结合 α 和 γ-亚基的支架，形成功能性 AM。而 γ-亚基主要作为腺苷酸结合区域，在低能量条件下，ADP 或 AMP 含量 ADP 与 γ-亚基结合能够改变 AMPK 构象，促进 Thr172 磷酸化(Xiao et al.,MPK 激活后，能够直接磷酸化一些与能量代谢和生长相关的重要下游底能够持续改变代谢的编程基因表达(Mihaylova and Shaw, 2011)，，使合成代代谢活动减弱，ATP 生成和机体的某些分解代谢增强。此外，AMPK 还可力传感器参与 DNA 损伤反应途径(Sanli et al., 2013)。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S827

【参考文献】