牦牛和藏猪常见原虫调查及藏猪肺线虫线粒体基因组分析

发布时间：2020-03-18 21:44

【摘要】：牦牛是地理分布非常有限的偶蹄动物之一,也是高寒地区特有牛种,更是高原地区支柱产业,当地牧民的主要经济来源之一。高寒藏香猪是世界上高海拔地带比较少见的小型猪种,亦是我国珍贵的、独有的猪种。然而,寄生虫病严重威胁着牦牛、藏猪的健康,也制约着牦牛、藏猪产业的发展,某些人畜共患寄生虫,更潜在威胁着人类的健康。近年来,牦牛频发腹泻病,至今尚不清楚导致牦牛腹泻的具体病原。而寄生虫所致的动物腹泻病,占所有腹泻疾病的40%。故为摸清我国珍贵动物(牦牛、藏猪)的常见原虫流行状态;初步挖掘牦牛腹泻的寄生虫病原体;揭示牦牛、藏猪寄生虫的分子特征、挖掘潜在的药物靶基因。本研究开展了牦牛、藏猪常见原虫的血清学调查;基于高通量测序的腹泻牦牛寄生虫病原调查;牦牛、藏猪寄生虫的分子特征研究;藏猪肺线虫线粒体基因组测序和分析,研究结果如下:1.我国高原牦牛、藏猪常见原虫血清学调查通过IHA或ELISA的检测方法对在采自我国高海拔地区的四个省份(西藏、青海、四川、甘肃)的3582份牦牛血清(2011-2017),开展了牦牛七种寄生虫(弓形虫、犬新孢子虫、泰勒虫、巴贝斯虫、棘球蚴、贝诺孢子虫、住肉孢子虫)的血清学检测。应用ELISA法对2016年采自西藏地区的454份藏猪血清进行了棘球蚴血清学检测。结果表明牦牛这七种寄生虫的总体阳性率分别为25.0%、6.3%、15.1%、21.5%、6.5%、1.1%、0.9%;藏猪棘球蚴阳性率为7.3%。2.我国牦牛、藏猪五种寄生虫线粒体基因扩增及序列分析本研究以在我国西藏地区某屠宰场收集的藏猪肺线虫、结节线虫、蛔虫、包虫的包囊及在四川红原地区采集的牦牛蛔虫为主要研究对象。通过对寄生虫虫体的线粒体分子标记进行基因克隆、序列纯化、基因测序。应用生物信息学软件DNAMAN、Mega等,分别对这五种寄生虫的9种线粒体基因进行了多序列比对和进化分析。结果发现感染我国藏猪的肺线虫为复阴后圆线虫,其中米林县、林芝县及工布江达县藏猪源复阴后圆线虫与澳大利亚野猪源复阴后圆线虫(NC_013813.1)同源性为97.5%-97.7%。感染藏猪的结节线虫为三种混合感染(齿食道口线虫、长尾肠结节虫、猩猩管口线虫)。其中猩猩管口线虫为首次在猪上发现。将从藏香猪胃和结肠分离的猩猩管口线虫与NCBI数据库比对发现,其与猩猩管口线虫(AJ619979.1)同源性分别为89%和90%。基于nad1、cox3和ITS三种分子标记基因,发现藏猪胃、盲肠、结肠的线虫阳性率分别为81.13%、66.04%和77.36%。藏猪蛔虫与猪蛔虫(日本、我国湛江)分离株的同源性为98.4%-99.9%,与人蛔虫(日本、巴西、我国临沭)分离株的同源性为99.4%-99.7%。藏猪包虫线粒体cox1基因与包虫G4型(AF346403.11)高度同源,说明感染藏猪的包虫为G4型。藏猪包虫线粒体atp6基因与包虫G6型(AY056613.1)同源性较高,说明感染藏猪的包虫为包虫G6型。感染牦牛的蛔虫为牛弓首蛔虫,且与牛弓首蛔虫(AJ937266.1)同源性为99.7%。3.腹泻牦牛寄生虫病原调查本研究从我国甘南地区,采集了健康成年牦牛、腹泻成年牦牛、腹泻犊牦牛的粪便样品,通过提取粪便微生物基因组DNA(g DNA)和进行18S SSU r DNA序列扩增,应用高通量测序法,全面分析了健康成年牦牛、腹泻成年牦牛、腹泻犊牦牛的粪便寄生虫的多样性与差异性。结果表明,在门水平上,健康成年牦牛、腹泻成年牦牛、腹泻犊牦牛的粪便均检测到线虫门和顶复亚门。其中三组牦牛在线虫门上,无显著差异性(p0.05);而在顶复亚门上,腹泻犊牦牛显著高于腹泻成年牦牛(p0.05)。在纲水平上,健康成年牦牛、腹泻成年牦牛、腹泻犊牦牛的粪便均检测到侧口纲、色矛纲和Gregarinasina(顶复亚门的一个纲),而仅有腹泻犊牦牛检测到旋毛纲和纤毛虫纲,但健康成年牦牛、腹泻成年牦牛、腹泻犊牦牛,在这5种纲水平上均未发现明显的差异(p0.05)。在目水平上,健康成年牦牛、腹泻成年牦牛和腹泻犊牦牛的粪便均检测到前庭目、三毛滴虫目、杆线虫目和Eugregarinorida(顶复亚门的一个目),而Neogregarinorida(顶复亚门的一个目)、毛滴目和Hypotrichomonadida(鞭毛虫刚的一类寄生虫),仅在腹泻成年牦牛的粪便检测到。腹泻成年牦牛在毛滴目上,显著高于健康成年牦牛(p0.05)和腹泻犊牦牛(p0.05),而健康成年牦牛、腹泻成年牦牛、腹泻犊牦牛,在这其它目水平上均未发现显著的差异(p0.05)。在科水平上,健康成年牦牛、腹泻成年牦牛和腹泻犊牦牛的粪便均检测到Simplicimonadidae(毛滴目下的一个科)和Haemonchidae(类毛样线虫上科)。而毛圆线虫科仅在健康成年牦牛和腹泻成年牦牛粪便检测到。毛滴虫科和网尾线虫科仅在腹泻成年牦牛粪便检测到。Plectidae(色矛纲下的一个科)、圆线虫科、Echinamoebidae(变形虫门下的一个科)、衣孢虫科、伪角毛虫科和Panagrolaimidae(线虫目下的一个科),仅在腹泻成年牦牛粪便检测到,且在毛滴虫科上,腹泻成年牦牛显著高于健康成年牦牛(p0.05)和腹泻犊牦牛(p0.05)。在属水平上,健康成年牦牛、腹泻成年牦牛和腹泻犊牦牛的粪便均检测到内变形虫属、布克斯顿纤毛虫属和血矛线虫属。而绕线属和Echinamoeba(变形虫门下的一个属),仅在腹泻成年牦牛的粪便中检测到。毛圆线虫属和锥滴虫属,在健康成年牦牛和腹泻成年牦牛的粪便均检测到,但腹泻犊牦牛的粪便未发现该虫属。簇虫属仅在腹泻犊牦牛的粪便检测出,健康成年牦牛和腹泻成年牦牛的粪便均未发现该虫属。在四毛滴虫属上,腹泻成年牦牛显著高于健康成年牦牛(p0.05)和腹泻犊牦牛(p0.05)。4.急性腹泻犊牦牛的寄生虫病原调查本研究从我国四川某牦牛牧区,采集了健康犊牦牛、急性腹泻犊牦牛的新鲜粪便样品。以粪便寄生虫为研究对象、以18S SSU r DNA为切入点、以高通量测序为载体,全面分析了健康犊牦牛、急性腹泻血便死亡犊牦牛的粪便寄生虫的多样性与差异性,以发掘潜在的寄生虫病原体。结果表明,在门水平上,健康犊牦牛、急性腹泻便血死亡犊牦牛的粪便均检测到顶复亚门、槽虫门、苔藓虫门,且健康犊牦牛在槽虫门上显著高于腹泻血便死亡犊牦牛(p0.0001),而在顶复亚门上,腹泻血便死亡犊牦牛明显高于健康犊牦牛(p0.0001)。副基体门仅在健康犊牦牛发现,而Blastocysta、变形虫门仅在腹泻血便死亡犊牦牛检出。在纲水平上,健康犊牦牛、腹泻血便死亡犊牦牛均检出Trichomonadea、Conoidasida、Phylactolaemata,而健康犊牦牛的Trichomonadea(p0.001)和Conoidasida(p0.0001)均显著高于腹泻血便死亡犊牦牛。Archamoebae、Aconoidasida、Blastocystidea这三纲仅在腹泻血便死亡犊牦牛粪便检出,而Hypotrichomonadea仅在健康犊牦牛检出。在目水平上,健康犊牦牛、腹泻血便死亡犊牦牛的粪便均检测到Tritrichomonadida、Eugregarinorida和Plumatellida,且Tritrichomonadida、Eugregarinorida在统计学上,健康犊牦牛明显高于腹泻血便死亡犊牦牛(p0.0001)。Pelobiontida、Piroplasmida、Blastocystida、Adeleorina这四目仅在腹泻血便死亡犊牦牛粪便均检测到,而Hypotrichomonadida仅在健康犊牦牛检出。在科水平上,健康犊牦牛、腹泻血便死亡犊牦牛的粪便均检测到Simplicimonadidae、Gregarinidae和Plumatellidae这3科,且在统计学上,健康犊牦牛的Simplicimonadidae(p0.0001)和Gregarinidae(p0.01)均显著高于腹泻血便死亡犊牦牛。Entamoebidae、Theileriidae、Trichomonadidae、Blastocystidae、Cryptosporidae这5科仅在腹泻血便死亡犊牦牛检测到,而Hypotrichomonadidae仅在健康犊牦牛检出。在属水平上,健康犊牦牛、腹泻血便死亡犊牦牛的粪便均检测到Simplicimonas、Gregarina,且健康犊牦牛在这两属上均明显高于腹泻血便死亡犊牦牛,p值分0.0001和0.01。Entamoeba、Theileria、Tetratrichomonas、Blastocystis、Cryptosporidium这五种属仅在腹泻血便死亡犊牦牛的粪便检出,而Hypotrichomonas仅在健康组犊牦牛的粪便检测到。5.高原藏猪肺线虫线粒体基因组分析本研究通过测序,将感染藏猪的肺线虫鉴定为萨氏肺线虫(Metastrongylus salmi),并首次揭示了藏猪M.salmi线粒体基因组信息。藏香猪M.salmi的线粒体基因组大小为13722 bp,碱基AT总含量为73.54%,核酸组成为A(23.52%)、C(6.14%)、G(19.60%)、T(50.02%)、N(UCAG)(0.73%)。包含12种蛋白编码基因(cox1、cox2、cox3、nad1、nad2、nad3、nad4、nad5、nad6、nad4L、atp6、cytb),22个t RNA和2个r RNA(rrn L、rrn S),而缺少编码atp8蛋白的基因。藏香猪M.salmi线粒体基因组中的nad4L、atp6、nad2、cob、cox3、cox1、cox2、nad5基因的3‘端会紧挨着一个trn碱基序。藏香猪M.salmi线粒体基因组可翻译氨基酸4237个,其中以ATA为起始密码子的最多41.7%(5/12);以TAA或TAG为终止密码子的有11个(91.7%)。藏猪M.salmi线粒体基因使用的密码子有63种,苯丙氨酸的密码子UUU的使用频率最高,而除密码子CGC外,脯氨酸的密码子CCC的使用次数最低。综上所述本研究阐明了我国珍贵动物(牦牛、藏猪)的七种寄生虫血清流行病学特点;初步探明了牦牛腹泻的潜在寄生虫病原;确定了5种寄生虫的线粒体基因的分子特征;揭示了藏猪肺线虫线粒体基因组信息、提供了分子标记和潜在的药物靶点信息。知己(不断提高疾病的预防和治疗水平等)和知彼(全面掌握寄生虫的流行状态、分子特征等),方能有效的解决我国高原牦牛、藏猪的寄生虫疾病,为促进我国畜牧业的蓬勃发展助力,为减少人畜共患寄生虫病对牧民的危害提供理论支持。
【图文】：

牦牛,藏猪,野牦牛,家养

图 1-1 家养牦牛(A)、野牦牛(B)、藏猪(C)Fig 1-1 Domestic yaks, wild yaks, Tibetan pig1.2 牦牛和藏猪的分布牦牛主要分布在高寒、缺氧地带（世界屋脊‖的青藏高原、天山及其周边山脉）

分布情况,牦牛,藏猪,世界

（图 1-3）（龚建军等 2009, Li et al 2016, Li et al 2017）。不同地区的藏猪，有着不同的地区性名称，如甘孜藏猪、西藏藏猪、迪庆藏猪等、蕨麻猪等等（周琳和王蜀金 2014）。由于藏猪有较高的经济价值，发展藏猪商品化产业养殖在我国多地区（包括两江、两湖、两广、重庆、山东等地）盛行起来，，且发展良好。关于藏香猪的具体数目，目前没有确切的统计。我国西藏有藏种猪大概 3 万头、养殖藏猪 40 余万头；四川有香猪种猪约 2 万头（强巴央宗等 2001）。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23;S858.28

【参考文献】