地方品种鸡群禽白血病流行病学调查及检测净化技术研究

发布时间：2020-03-20 09:11

【摘要】：禽白血病是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)/肉瘤病毒群病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。根据病毒囊膜蛋白的抗原性,ALV可分为A～J 10个亚群,以及新鉴定的K亚群。其中,对鸡具有致病性的外源性ALV包括A、B、C、D、J和K亚群。自1908年首次报道并分离到ALV以来,世界上许多国家都有该病的发生和流行,我国肉鸡、蛋鸡及地方品种鸡群也普遍存在ALV的感染。除典型的肿瘤性病变外,ALV感染引起的免疫抑制、生长迟缓、产蛋下降等亚临床表现所造成的经济损失更为严重。禽白血病是垂直传播性疫病,至今尚无有效的药物和疫苗可供使用,控制该病最有效的措施是通过病原检测,淘汰阳性鸡,达到净化种群的目的。国际育种公司在20世纪80年代末就实现了对经典外源性ALV的净化,2005年前后又实现了 ALV-J的基本净化。国内一些自繁自养的育种公司从2002年起也开始在种鸡核心群开展禽白血病净化,有些已取得显著效果。但在大多数黄羽肉鸡和众多地方品种鸡群中,禽白血病仍在流行和蔓延,对我国家禽种质资源的安全构成了极大威胁。本研究对某原种场保存的20多个地方品种鸡进行了禽白血病流行病学调查,全面了解地方品种鸡群禽白血病感染动态;并对分离到的一株ALV-K全基因组做了系统分析,解析其来源及分子特性;针对地方品种鸡群流行最广的ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K,建立了多重PCR检测方法;为丰富禽白血病检测净化技术,对种公鸡精液ALV检测方法进行了摸索和可行性分析;在此基础上,对DX、LY、XJ和LH 4个地方品种鸡核心群开展了禽白血病净化示范,验证和完善净化技术方案,为原种场禽白血病净化提供参考依据。1.地方品种鸡群禽白血病流行病学调查为深入了解我国地方品种鸡群禽白血病流行情况,2013～2017年间对某原种场从全国各地收集并保存的26个地方品种鸡开展了禽白血病流行病学调查,包括血清学ALV-J和ALV-A/B抗体检测、蛋清p27抗原检测、血浆和组织病料病毒分离检测等;对部分外源性ALV分离株前病毒DNA的env基因进行克隆和测序,将分离株gp85氨基酸序列与GenBank登录的各亚群ALV参考株进行比对和绘制遗传进化树,鉴定病毒亚群,并进行序列分析。血清学调查结果显示,有22个鸡种ALV-J抗体呈阳性,18个鸡种ALV-J和ALV-A/B抗体呈双阳性,且绝大多数(19/26)鸡种ALV-J抗体阳性率高于ALV-A/B抗体,个别鸡种ALV-J抗体阳性率大于50%。蛋清p27抗原检测结果显示,各品种鸡群均存在排毒状态的母鸡,尤其YJ、WX、BJ、DJ和ZJ鸡种蛋清p27抗原阳性率高于50%。血浆病毒分离检测结果表明,各品种鸡对ALV均易感,感染水平存在显著差异;大部分(15/21)鸡种母鸡病毒血症阳性率高于公鸡,但差异不显著。56个外源性ALV分离株经亚群鉴定,27株为ALV-J,17 株为 ALV-K,8 株为 ALV-B,3 株为 ALV-A,1 株为 ALV-C。其中,有 9 株 ALV-J、3株ALV-K、1株ALV-A分离自组织病料;其余毒株均分离自表观健康鸡群血浆样品。表明,ALV-K已成为除ALV-J外,对地方品种鸡感染最严重的外源性ALV。与参考株相比,ALV分离株gp85氨基酸序列普遍存在点突变、插入或缺失性变异,部分变异呈规律性。研究结果证实了禽白血病在地方品种鸡群感染的普遍性和复杂性,开展禽白血病净化工作势在必行。2.K亚群禽白血病病毒全基因组测序及分析为全面了解ALV-K基因组特性,本研究对在流行病学调查过程中从LY鸡种血浆样品分离鉴定的一株ALV-K(JS13LY19株)前病毒DNA进行了分段克隆和测序,获得全长基因组序列,并将其各基因片段与GenBank登录的ALV参考株进行比对分析。结果显示,JS13LY19株基因组全长7483bp,符合复制完整C型反转录病毒特征,缺乏肿瘤基因。其gp85氨基酸序列与ALV-K参考株一致性90.9%～98.6%,显著高于其它亚群ALV,遗传进化树上与ALV-K参考株划为同一支;其中,与ALV-K原型株JS11C1一致性最高,二者显示出较多位点的规律性变异,但也存在5个位点差异。JS13LY19株gag、pol、gp37、LTR、UTR与内源性ALV显示更高的一致性(92.0%～99.4%);LTRU3区比大部分外源性ALV LTR少了一个CAAT enhancer盒、PRE盒、CArG盒及Y盒。推测,JS13LY19株极有可能是JS11C1株与内源性ALV重组产生。拥有内源性ALVLTR及U3区转录调控元件的部分缺失,可能使JS13LY19株转录能力下降而致病性降低,其生物学特性有待进一步研究。3.禽白血病病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用流行病学调查结果显示,鸡群中存在的外源性ALV主要包括ALV-J、ALV-K、ALV-A和ALV-B。为快速掌握鸡群感染状态,本研究针对ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K参考株,设计了一条通用上游引物PF和四条特异性下游引物AR、BR、JR和KR,通过构建质粒标准品,对最适引物浓度、退火温度、循环数等反应条件进行优化,建立了一种能同时检测ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的多重PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行了验证,将其应用于从地方品种鸡群分离的119份ALV样品的检测中。试验结果显示,使用 0.2 μM PF、0.1 μM AR、0.1 μM BR、0.1 μM JR 和 0.1 μM KR,56.0℃退火温度和30个循环的反应条件,建立的多重PCR方法检测效果最优,能检测出最低10 pg/μL的ALV前病毒DNA样品,特异性高,重复性好。对ALV样品的检测结果与流行病学调查结果基本相符,并能更高效地检测出ALV的多重感染。表明,地方品种鸡群除单一感染外,还存在 ALV-B+J、ALV-J+K 的二重感染,以及 ALV-A+B+J、ALV-A+B+K、ALV-B+J+K的三重感染。本研究为禽白血病流行病学调查及外源性ALV初步鉴定提供了技术支撑。4.种公鸡精液禽白血病病毒检测方法研究与应用选择合适的检测材料与方法对禽白血病净化会起到事半功倍的效果,为探讨种公鸡精液ALV检测的可行性与实用性,本研究对LK品种种公鸡精液经过滤、稀释、离心、冻融等不同处理方法,以及精液不同稀释度对病毒分离效果的影响进行了研究,并将确定的检测方法应用于LK、MQ和LH 3个品种种公鸡的检测净化中,同时与血浆病毒分离或血浆斑点杂交检测结果进行比较。结果,以血浆病毒分离为标准,精液样品经稀释离心后,取上清接种DF-1细胞,确保在培养基中最终稀释度为1:28～1:56时病毒分离效果最佳。初步应用结果显示,不同鸡种精液p27抗原ELISA检测阳性率均最高,但并不能将血浆和精液病毒分离检测为阳性的鸡均检出,存在“假阴性”;同一鸡种血浆和精液病毒分离阳性率高低不同,在LK和MQ种公鸡中,二者阳性符合率均低于50%,两种方法不可互相取代;LH种公鸡精液病毒分离阳性率显著高于血浆病毒分离,亦高于血浆斑点杂交,二者阳性符合率分别为100%和36.4%,精液病毒分离效果优于血浆病毒分离。研究结果提示,对种公鸡精液进行ALV检测具有可行性和必要性,由于不同鸡种净化进程不同、带毒排毒状态不一,检测方法也应灵活运用。本研究为种禽场禽白血病净化材料的选择与方案制定提供了参考依据。5.地方品种鸡群禽白血病示范性净化本研究在2013～2016年间对原种场保存的DX、LY、XJ和LH 4个鸡种核心群开展了禽白血病净化,通过新建净化鸡舍,采用1日龄胎粪p27抗原检测、6周龄血浆病毒分离、25～27周龄血浆/精液病毒分离+蛋清p27抗原检测、36～40周龄血浆/精液病毒分离+蛋清p27抗原检测等净化方案,在强化饲养管理的基础上,经过2～3个世代净化,各品种鸡群取得了显著净化效果。DX鸡种经过3个世代净化,25～27周龄蛋清p27抗原阳性率由26.4%降至0.3%,36～40周龄血浆病毒分离阳性率由36.4%降至0.4%,公鸡病毒分离阳性率连续2个世代均为零;LY鸡种经过3个世代净化,6周龄血浆病毒分离阳性率由33.2%降至1.2%,36～40周龄蛋清p27抗原和血浆病毒分离阳性率均降至零;XJ鸡种经过2个世代净化,留种前血浆病毒分离阳性率由61.8%降至0.9%;LH鸡种经过2个世代净化,留种前蛋清p27抗原阳性率由20.7%降至1.9%,血浆病毒分离阳性率降至0.2%。禽白血病净化对种鸡生产性能的影响,以DX鸡种为例,经过3个世代净化,育雏期、育成期和产蛋期死亡率均逐级下降,净化第一世代效果最为显著;产蛋性能亦明显提高,43周龄总产蛋数平均增加了 13枚/只,66周龄总产蛋数平均增加了 23枚/只。本研究为众多地方品种鸡群及原种场禽白血病净化工作的开展起到了良好的示范作用。
【图文】：

模式图,反转录病毒,模式图,粒子

１．１．１病毒分类地位逡逑根据国际病毒分类委员会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ邋Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ邋ｏｎ邋Ｔａｘｏｎｏｍｙ邋ｏｆＶｉｒｕｓｅｓ，ＩＣＴＶ）发逡逑布的第九次分类报告（２０１１），，如图１－１所７Ｋ，禽白血病病毒（Ａｖｉａｎ邋ｌｅｕｋｏｓｉｓ邋ｖｉｒｕｓ，ＡＬＶ）逡逑属于反转录病毒科、正反转录病毒亚科、甲型反转录逡逑病毒属，且是该属的代表种。与ＡＬＶ同为甲型反转录病毒属的还有罗逡逑斯肉瘤病毒（Ｒｏｕｓ邋ｓａｒｃｏｍａ邋ｖｉｒｕｓ，ＲＳＶ）、禽癌病毒－米尔希尔邋２邋株（Ａｖｉａｎ邋ｃａｒｃｉｎｏｍａ邋Ｍｉｌｌ邋Ｈｉｌｌ逡逑ｖｉｒｕｓ邋２）、禽成髓细胞瘤病毒（Ａｖｉａｎ邋ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ邋ｖｉｍｓ）、禽骨髓细胞瘤病毒２９株（Ａｖｉａｎ逡逑ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ邋ｖｉｒｕｓ邋２９）等。逡逑Ｖｉｒｕｓ邋Ｔａｘｏｎｏｍｙ：邋２０１８邋Ｒｅｌｅａｓｅ逡逑ｔ邋Ｃ邋５＾逦ＯＣ逡逑ｔｍＭｉ逡逑Ｉ？＇：二’艾－ｆ－ｔｔ邋二人

示意图,前病毒,基因组结构,示意图

译产生前体蛋白质和成熟蛋白质并组装成病毒粒子。前病毒ＤＮＡ具有病毒ＲＮＡ相同的基逡逑因组序列，仅在两端延长形成Ｕ３－Ｒ－Ｕ５重复序列，成为长末端重复序列（ＬＴＲ），ＬＴＲ在逡逑前病毒ＤＮＡ整合及病毒ＲＮＡ复制、翻译中起重要作用。ＡＬＶ前病毒基因组结构见图１－３＿。逡逑？５邋ＬＴＲ－逦－３邋Ｉ．ＴＫ逡逑－５ＵＴＲ逦ｇａｇ逦Ｐ0ｌ逦邋－３－ｌＪＴＲ－逡逑｜１邋；？？逡逑Ｕ３邋Ｋ邋Ｕ５邋ｆｉｌ９邋ｐｉ0ｐ２７ｐｌ２ｐ，５邋ＲＴ逦ＩＮ逦ｇｐ８５邋Ｂ，＇逦Ｕ３邋Ｒ邋Ｕ５逡逑图１－３邋ＡＬＶ前病毒基因组结构示意图逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＡＬＶ－Ｊ邋ｐｒｏｖｉｒｕｓ邋ｇｅｎｏｍｅ逡逑根据致瘤性的快慢，ＡＬＶ可分为慢性转化型ＡＬＶ和急性转化型ＡＬＶ［１８］。急性转化型逡逑病毒感染后可很快诱发肿瘤，大部分急性转化型ＡＬＶ是复制缺陷病毒，其部分ｇｆｌｇ、ｐｏ／逡逑或基因被肿瘤基因所取代，不能单独形成完整的病毒粒子，必须以复制完整型ＡＬＶ作逡逑为辅助病毒，方可复制、感染宿主细胞［１９］。至今已发现多种肿瘤基因可整合进ＡＬＶ基因逡逑组中，如邋ｓｒｃ、ｆｐｓ、ｙｅｓ、ｒｏｓ、ｅｙｋ、ｊｕｎ＇邋ｑｉｎ、ｍａｆ、ｃｒｋ、ｅｒｂＡ、ｅｒｂＢ、ｓｅａ、ｅｔｓ、ｍｙｂ、ｍｙｃ、逡逑ｍ／／基因等［２Ｑ］。这些肿瘤基因多数来自细胞染色体基因组，发挥着生长调控作用［２１￣２３］。慢逡逑性转化型ＡＬＶ基因组不含肿瘤基因
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.31

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