实验用牛、羊贾第虫与隐孢子虫多重PCR方法的建立与应用

发布时间：2020-03-20 08:49

【摘要】：贾第虫(Giardia)与隐孢子虫(Cryptosporidium)属于重要的人兽共患性原虫,其感染宿主广,感染后临床症状以腹泻为主,并对畜牧业与养殖业造成巨大的经济损失。隐孢子虫病不仅可以引起哺乳动物的严重腹泻和禽类的呼吸道疾病,而且还可引起人的严重腹泻以及继发感染艾滋病(AIDS)病人,是这类病人死亡的主要原因之一。隐孢子虫被列为150多种水传病原中危害最大的一种微生物;被美国疾病控制和预防中心(CDC)列为B类生物战剂。微小隐孢子虫(C.parvum)引起的疾病为隐孢子虫病,寄生于人和大多数哺乳动物,主要以腹泻为主,严重时可危及生命。安氏隐孢子虫(C.andersoni),主要引起幼龄动物的消化道和呼吸道疾病,导致其生产性能下降或死亡。十二指肠贾第虫(G.duodenalis)寄生于人的胆囊和小肠中,主要寄生于十二指肠,引起的疾病为贾第虫病,临床表现主要为腹痛腹泻、呕吐发热、消瘦厌食等。贾第虫病在欧美等许多国家曾多次暴发流行,我国该病分布也很广泛。据报导我国人贾第虫的总感染率为2.52%,吉林省犬贾第虫感染率高达25.20%。我国公布的城市供水水质标准和生活饮用水卫生标准均把隐孢子虫和贾第虫检测作为必检指标。贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫的感染多因水源被其包囊或卵囊污染继而引发感染,且其感染的共同症状主要为腹泻,所以对贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫的检测在公共安全方面尤为重要。当牛羊被这三种寄生虫感染时导致自身机能下降免疫力降低,无论是饲料利用率还是产奶量和出栏率都大大降低,并且牛羊在科研工作中作为重要的实验用动物有着极其重要的影响,感染后用作实验动物时直接影响实验人员的实验数据与结果分析。同时贾第虫、隐孢子虫属于人兽共患寄生虫,无论是对于养殖人员还是实验人员都存在安全隐患,所以本试验建立了实验用牛、羊贾第虫与隐孢子虫多重PCR的方法检测方法,并进行了流行病学调查,为实验用动物的质量控制及隐孢子虫病及贾第虫病的防治提供技术支持。实验用羊微小隐孢子虫与十二指肠贾第虫双重PCR的建立,选择高度保守性隐孢子虫18S rRNA基因与贾第虫TPI基因设计引物,通过各项条件的优化选择,确定退火温度为57℃,延伸时间为30s,灵敏度为5×10~2/g粪便,特异性良好。应用已建立的实验用羊微小隐孢子虫与十二指肠贾第虫双重PCR方法,检测自长春以及白城不同地区193份羊粪样品,十二指肠贾第虫阳性粪48.7%(94/193),基因型为聚集体A;微小隐孢子虫阳性粪便样为2.6%(5/193),基因型为C.parvum IIa。实验用牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫三重PCR的建立,选择高度保守性隐孢子虫18S rRNA基因与贾第虫TPI基因设计引物,通过各项条件的优化选择,确定退火温度为58℃,延伸时间为60s,灵敏度为1×10~3/g粪便,特异性良好。应用已建立的实验用牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫三重PCR方法,检测自长春不同地区的156份牛粪样,十二指肠贾第虫阳性粪便样77.6%(121/156),基因型为聚集体A;微小隐孢子虫阳性粪便样3.2%(5/156),基因型为C.parvum genotype II、Human C.parvum genotype HFL5。
【图文】：

微小隐孢子虫,贾第虫,双重PCR,十二指肠

图1.1双重PCR引物验证M：DL2000marker1：微小隐孢子虫；2：十二指肠贾第虫

双重PCR,退火温度,小隐孢子虫,特异性

同退火温度双重 PCR 结M：DL2000 marker 59°C、57°C、55°C、53°nealing temperature DoublM：DL2000 markere is 59°C、57°C、55°C、5应特异性实验十二指肠贾第虫与微小隐小隐孢子虫均扩增出相应、大肠杆菌 O157 作为模板有良好的特异性（见图 1
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S855.99

【参考文献】