鸭疫里默氏菌荚膜合成基因wza及wzc功能初探

发布时间：2020-03-20 11:46

【摘要】：鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)是严重危害养鸭业的重要病原,我们在开展RA CH-1株基因组功能注释时,发现编码B739-1124和B739-1125蛋白的基因具有多糖输出蛋白(wza)和多糖共聚酶蛋白(wzc)基因的生物信息学特性,为探究RA wza和RA wzc基因功能,我们通过基因缺失等方法开展系列研究,主要内容和结果如下:1.鸭疫里默氏菌wza及wzc基因缺失株的构建及生物学特性测定通过同源重组构建RA CH-1株的wza基因缺失(RA CH-1Δwza)株、wzc基因缺失(RA CH-1Δwzc)株、wza和wzc双基因缺失(RA CH-1Δwzac)株及对应的缺失回补株(cRA CH-1Δwza株、cRA CH-1Δwzc株),对wza及wzc基因缺失后RA的生物学特性检测,结果表明:(1)RA在TSA固体培养基生长形成的菌落由起隆、表面湿润、有光泽菌落变为扁平、表面粗糙菌落,且菌落直径变小,菌落黏液化特性消失;(2)印度墨汁染色结果显示,荚膜结构不完整或未能形成荚膜;(3)透射电镜下,可观察到荚膜变薄甚至消失;(4)生长繁殖的速度减缓,进入各生长周期的时间均往后推延2 h左右;(5)经过蛋白酶K处理、SDS-PAGE电泳及银染等方法鉴定,wza、wzc参与RA的荚膜多糖(CPS)合成而不是脂多糖(LPS)的合成;(6)Percoll密度梯度离心证实其浮力密度增强;(7)抗干燥、抗氧化(H_2O_2)能力显著降低。相应的回补株能够使缺失株的以上生物学特性得以恢复至野生株(RA CH-1)水平或接近野生株水平。2.wza及wzc基因缺失对鸭疫里默氏菌表面性质的影响细菌表面疏水性与自动聚集能力是影响细菌菌体黏附力的重要因素,其中荚膜是位于菌体表面的物质,是决定细菌表面疏水与自动聚集能力强弱的因素之一。为探究wza或wzc基因缺失对RA表面性质的影响,采用碳氢化合物黏着法测定了表面疏水性、沉降法测定自凝集能力、试管和96孔板培养后结晶紫染色进行生物膜定性和定量测定。结果表明:(1)RA CH-1Δwza株的表面疏水性(26.10%)及RA CH-1Δwzc株的表面疏水性(27.59%)较RA CH-1株的表面疏水性(14.36%)显著提高(p0.001),表明wza或wzc基因的缺失影响了具有很好的亲水性的荚膜多糖的输出,从而导致表面疏水性的增强;(2)经过12 h沉降,RA CH-1Δwza株及RA CH-1Δwzc株的OD_(600)值分别为0.20和0.21,而RA CH-1株OD_(600)值为0.90,表明wza或wzc基因缺失后自动凝集能力显著提高(p0.001);(3)试管和96孔板气液交界的培养物,wza、wzc和wzac基因缺失株经过结晶紫染色后能够清楚地观察到形成的生物膜,而野生株、回补株无明显生物膜形成,测定OD_(595)值分析表明wza或wzc基因缺失后RA的生物膜形成能力显著增强(p0.001)。3.wza或wzc基因缺失对RA致病力的影响细胞黏附与入侵能力、半数致死量(LD_(50))、致感染宿主发病及组织损伤和病变的能力等,是判定细菌致病力的重要指标。对wza、wzc和wzac基因缺失后RA的这些指标检测结果表明:(1)对Vero细胞的黏附细菌数、入侵细菌数均显著(p0.001)高于野生株,表明黏附和入侵能力增强:(2)感染7日龄雏鸭后,RA CH-1Δwza株(LD_(50)为1.99×10~100 CFU)及RA CH-1Δwzc株LD_(50)为1.26×10~100 CFU),分别较野生株(LD_(50)为7.94×10~7 CFU)毒力分别下降250倍和159倍;(3)感染7日龄雏鸭后1d、3d和5d的血液中均分离不到相应缺失株,而野生株的血液载菌量达到10~6-10~8 CFU/mL;(4)感染7日龄雏鸭,野生株感染后的雏鸭的肝索结构紊乱、肝细胞坏死、肿胀、细胞核浓缩,并出现弥漫性脂肪变性,心脏心外膜增厚水肿、表面有纤维素渗出物,脑实质内血管明显扩张充血、其间可见炎性细胞弥散性浸润、血管周围可见淋巴细胞和胶质细胞形成的“管套”现象,而各缺失株感染后的雏鸭的肝、脑、心脏组织病变不明显,表明对雏鸭致致病变能力显著下降;(5)在50%正常鸭血清中不能存活。当wza、wzc基因回补后,以上特性可恢复至野生株水平。因此,wza和wzc基因缺失后,RA对Vero细胞的黏附与入侵的能力均显著增强,但感染鸭后更容易被宿主介导的补体杀伤,对宿主鸭的致病能力减弱。4.Wzc蛋白的酪氨酸磷酸化及Wzc与Wza互作初探构建的截短pET-28a(+)-Wzc E521-F765和pET-28a(+)-Wzc E521-F790表达质粒分别转入至转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)后,结果证实均为可溶性表达。其中,Wzc E521-F765为不含C端酪氨酸富集区的片段,不能被特异性磷酸化酪氨酸单克隆抗体4G10所识别;Wzc E521-F790为含有C端酪氨酸富集区的片段,能被特异性磷酸化酪氨酸单克隆抗体4G10所识别,因此,Wzc磷酸化位点均位于C端酪氨酸富集区域。化学交联法证实,Wza和Wzc能发生相互作用。综上:RA wza及wzc基因缺失影响了荚膜的输出和细菌的生长,导致表面疏水性、自凝集能力、生物膜形成能力增强,降低了致病性,Wzc蛋白C端酪氨酸富集区域是主要的磷酸化位点,Wzc与Wza发生相互作用参与荚膜多糖的合成与输出。
【图文】：

EPS）[66]。这三种多糖在细菌细胞表面的分布见图1-2所示。CPS由1-6个单糖组成的重复单元通过糖苷键连接起来形成，在细菌表面形成多糖层[67-69]。LPS由2-8个寡糖重复单元连接到脂质A上锚定在细胞外膜上[70-73]。EPS则是一些未粘附在细菌表面的分泌糖原[43, 74]。细菌表面多糖的合成和转运需要一些酶参与，比如外膜多糖输出蛋白、多糖共聚酶蛋白、糖基转移酶等。3.2 革兰阴性菌 CPS、LPS 和 EPS 的组装机制细菌表面多糖组装及合成机制主要分为4种，包括依赖Wzx /Wzy合成途径、依赖ABC转座子合成途径、合酶合成途径、胞外蔗糖酶合成途径[75, 76]。依赖Wzx /Wzy合成途径是最主要的表面多糖合成机制，，参与多种多糖的组装。依赖ABC转座子合成途径主要涉及细菌CPS的合成。合酶合成途径及胞外蔗糖酶合成途径主要在革兰氏阳性菌EPS的合成中发挥作用，其机制不是很清楚。依赖Wzx/Wzy合成途径需要Wzx、Wzy和其他蛋白的参与。此合成途径的CPS中主要包括如下几类功能的基因：单糖合成酶基因、调节基因、糖基转移酶基因（GTs）、寡糖重复单位聚合酶基因（wzy）、翻转酶基因（wzx）以及一些修饰基因（如乙酰转移酶、异构酶基因等）[77]。大肠杆菌1群荚膜的合成通过依赖Wzx /Wzy途径如图1-3所示。起始阶段：位于胞质内糖核苷将糖基磷酸转移到十一碳二烯磷酸酯（undecaprenyl phosphate，Und-p）上形成Und-pp连接的糖链；延伸-转位-聚合阶段：起始反应后，在糖基转移酶的催化下将不同的单糖残基依次添加到Und-PP-糖链上形成Und-PP-重复单元

图 1-3 CPS 组装和输出通路原理图依赖ABC转运系统通路（紫色区域）和依赖Wzx/Wzy合成途径（绿色区域）。Fig.1-3 Schematic representation of the CPS assembly and export pathwaysABC-dependent pathway (purple region) and Wzy-dependent pathway (green region).
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 丁何文;;鸭疫里默氏菌病的诊治与体会[J];兽医导刊;2018年15期

2 范梦男;彭佳顺;周琴;李欢;江胜;李阁;李继祥;;规模化鹅场鸭疫里默氏菌感染的诊治[J];江西畜牧兽医杂志;2016年05期

3 梁建明;;鸭疫里默氏菌病诊治与体会[J];福建畜牧兽医;2013年06期

4 张志刚;;一起快大肉鸭鸭疫里默氏菌病的诊疗报告[J];福建畜牧兽医;2013年06期

5 宁玲忠;雷红宇;胡仕凤;颜运秋;杨李梅;;鸭疫里默氏菌病研究进展[J];湖南畜牧兽医;2013年03期

6 陈永亮;戚邦帅;;徐州地区鸭疫里默氏菌病的流行病学调查[J];中国兽医杂志;2012年05期

7 邱彦;周小容;罗文秀;;鸭疫里默氏菌的分离及高密度发酵培养方法的研究[J];兽医导刊;2011年S1期

8 黄勇;;樱桃谷鸭鸭疫里默氏菌病的诊治[J];福建畜牧兽医;2009年02期

9 盘美妮;蒋柳平;谭明芳;;鸭疫里默氏菌病的诊治[J];畜牧兽医科技信息;2009年06期

10 虞建军;;鸭疫里默氏菌病的诊治[J];福建畜牧兽医;2009年04期

相关会议论文 前10条

1 万春和;程龙飞;陈红梅;傅光华;傅秋玲;施少华;陈翠腾;刘荣昌;黄瑜;;Ⅱ型鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因的原核表达[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会暨第十七次全国学术研讨会论文集[C];2017年

2 张起泉;;鸭发生鸭疫里默氏菌病的诊疗报告[A];福建省畜牧兽医学会2009年学术年会论文集[C];2009年

3 王腾;纪丽丽;王淑侠;韩相敏;李爽;章丽娇;宋金成;苏文良;何伟勇;苏敬良;;鸭疫里默氏菌基因分型研究[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2012年

4 王慧强;白如念;杨秀环;王勇月;苏敬良;;种鸭鸭疫里默氏菌性关节炎诊断[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2012年

5 刘文华;苏敬良;刘颖;许秀梅;金鑫;吴培福;;16S rRNA基因分析在鸭疫里默氏菌鉴定中的应用[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会第六届代表大会论文集[C];2006年

6 万春和;程龙飞;陈红梅;傅光华;施少华;黄瑜;;鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因特征[A];中国畜牧兽医学会2014年学术年会论文集[C];2014年

7 郑茗予;汪铭书;贾仁勇;陈舜;刘马峰;赵新新;杨乔;吴英;张沙秋;程安春;朱德康;;鸭疫里默氏菌对喹诺酮耐药机制的研究[A];中国畜牧兽医学会2018年学术年会禽病学分会第十九次学术研讨会论文集[C];2018年

8 周春宇;程安春;汪铭书;;间接免疫荧光检测石蜡切片中鹅细小病毒方法的建立[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集[C];2005年

9 马逊;程安春;汪铭书;朱德康;贾仁勇;罗启慧;刘菲;陈孝跃;;鸭传染性浆膜炎研究概况[A];第三届中国水禽发展大会会刊[C];2009年

10 程龙飞;傅秋玲;陈红梅;傅光华;施少华;万春和;黄瑜;;鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶的原核表达[A];第四届全国禽病分子生物技术青年工作者会议论文集[C];2015年

相关重要报纸文章 前1条

1 福建省长泰县畜牧兽医站 刘长木;番鸭细小病毒病与鸭疫里默氏菌病混合感染的诊治[N];江苏农业科技报;2006年

相关博士学位论文 前3条

1 何阳;鸭疫里默氏菌CRISPR-Cas系统抵御外源DNA功能初探[D];四川农业大学;2018年

2 张欣;鸭疫里默氏菌B739_0873基因功能研究[D];四川农业大学;2018年

3 易海波;鸭疫里默氏菌荚膜合成基因wza及wzc功能初探[D];四川农业大学;2018年

相关硕士学位论文 前10条

1 孙嘉凯;鸭疫里默氏菌对利福平的耐药机制初探及rpoB基因突变的适应性研究[D];四川农业大学;2018年

2 原慧;鸭疫里默氏菌CH-1株gldK基因的功能研究[D];四川农业大学;2017年

3 杨雪芹;鸭疫里默氏菌CH-2株O-抗原基因簇的解析与G148_0871基因的功能研究[D];四川农业大学;2017年

4 雷红宇;实验性鸭疫里默氏菌病病理学研究[D];湖南农业大学;2001年

5 杨晓辉;不同毒力1型鸭疫里默氏菌外膜蛋白的比较蛋白质组学研究[D];江西农业大学;2012年

6 张克新;血清2型鸭疫里默氏菌54KD外膜蛋白免疫原性研究[D];中国农业大学;2004年

7 霍翠梅;鸭疫里默氏杆菌检测方法的建立[D];山东农业大学;2007年

8 范梦男;R.antipestifer s基因的克隆表达及EcpS对宿主补体系统的作用[D];西南大学;2017年

9 潘海城;一株鸭疫里默氏菌部分生物学特性分析[D];福建农林大学;2010年

10 王艳;鸭疫里默氏菌制苗菌株筛选及大罐发酵培养工艺条件优化[D];吉林大学;2013年

本文编号：2591734