禽呼肠孤病毒在不同细胞系中增殖规律及其σB、σC基因在杆状病毒系统中表达的研究

发布时间：2020-03-21 04:52

【摘要】：禽呼肠孤病毒(ARV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)分支的重要成员,感染宿主常为鸡、番鸭及一些鸟类,常见临床病症有吸收不良综合征、病毒性关节炎以及免疫抑制性疾病。ARV危害严重,给世界养禽业造成了难以估量的经济损失。研究发现,ARV可以在鸡肝癌(LMH)细胞系、绿猴肾(Vero)细胞系、鸡胚成纤维(DF-1)细胞系等多种细胞系中进行增殖,但有关于其增殖规律的研究尚未见报道。杆状病毒表达系统是基因工程的四大表达系统之一,其具有外源基因表达量高、可携带较大的基因片段、表达产物生物活性好等多种优势。ARV编码的σB、σC蛋白是其病毒粒子的外衣壳蛋白,σB蛋白携带有群特异型中和抗原决定簇,σB蛋白通过σC蛋白作用,提高ARV感染细胞的能力。σC蛋白携带有ARV特异性中和反应的表面抗原,能刺激机体产生保护性的中和抗体,并与病毒粒子的吸附、增殖等过程有关。因此,σB蛋白和σC蛋白是研制ARV疫苗的首选蛋白。为此,本课题首先研究了 ARV在几种细胞系中的增殖特性,随后通过杆状病毒表达系统表达ARVσB、σC抗原蛋白,并分析其生物学活性。以期为ARV的防控提供理论依据和技术支撑。本研究结果主要分为四部分。1.ARV增殖特性的研究将ARVS1133毒株梯度稀释接种鸡肝癌(LMH)细胞系、非洲绿猴肾(Vero)细胞系和鸡胚成纤维(DF-1)细胞系,分别测定ARV感染三种细胞系后八个时间点(0h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h)的病毒滴度,并绘制ARV在三种细胞系上的生长曲线,分析其增殖规律。结果显示,ARV在Vero细胞系上增殖更快,病毒滴度更高,稳定期更长,更适合ARV的增殖。同时产生稳定的CPE,且在感染后48 h达到病毒滴度峰值,为1×10-8 46/0 1 mL。2.构建ARV σB、σC基因的表达载体分析NCBI数据库中σB、σC基因与表达载体序列特征,设计特异性引物扩增σB、σC基因并构建其重组表达载体,命名为σB-pFastHTB、σC-pFast Dual,对重组表达载体进行双酶切验证及测序验证。结果显示,成功扩增了σB、σC全长基因,并克隆至表达载体上,构建了σB、σC基因的重组表达载体。3.σB、σC蛋白在Sf9细胞中的可溶性表达将σB、σC重组质粒转化DH10感受态细胞,筛选阳性克隆,提取重组杆粒后分别转染Sf9细胞,获得了其重组杆状病毒,命名为BacSC-σB、BacSC-σC。并进行细胞形态学观察、DNA水平验证以及mRNA转录水平验证,同时测定其病毒滴度。研究结果表明BacSC-σB、BacSC-σC成功感染Sf9细胞,且转染后的Sf9细胞出现胞核变大,胞内出现颗粒样物质等典型CPE,重组杆状病毒转染Sf9细胞后的DNA提取物及RNA提取物均能检出目的片段大小的条带,BacSC-σB 的 TCIDso 为 10-9 42/0.1 mL、BacSC-σC 的 TCID50 为 10-8 31/0.1 mL。4.σB、σC蛋白的初步验证提取重组蛋白,命名为rBacSC-σB、rBacSC-σC,对重组蛋白进行IFA、SDS-PAGE及Western Blot初步验证。结果表明:σB、σC蛋白成功在Sf9细胞中表达;IFA结果显示重组杆状病毒BacSC-σB、BacSC-σC感染的Sf9细胞均出现绿色荧光;SDS-PAGE、Western Blot结果显示rBacSC-σB在41kD处有蛋白条带,rBacSC-σC在35kDa处有蛋白条带,表明σB、σC重组蛋白成功在Sf9细胞中表达,且能与ARV阳性血清抗体反应,表现出较好的反应原性。本研究获得了 ARV在几种细胞系中的增殖规律资料,完成了在杆状病毒表达系统中σB、σC蛋白的表达与鉴定,为下一步ARV疫苗的研究提供实验依据与技术支撑。
【图文】：

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细胞,细胞形态

洌妫妫隆ⅲǎ罚没饷蛟诟俗床《鞠低持斜泶锏难芯浚]3?ＬＭＨ、Ｖｅｒｏ、ＤＦ－１细胞感染ＡＲＶ后均出现了细胞破碎、脱落、萎缩、边缘模糊等ＣＰＥ，，逡逑对照组的细胞均生长良好。ＣＰＥ结果见图２－１、２－２、２－３。逡逑■■ＭＭ逡逑图２－１正常ＬＭＨ细胞（Ａ）与ＡＲＶＳ１１３３感染的ＬＭＨ细胞（Ｃ－Ｄ）逦（４００Ｘ）逡逑Ａ：正常的ＬＭＨ细胞形态；Ｂ：接毒２４ｈ的ＬＭＨ细胞形态；Ｃ：接毒４８ｈ的ＬＭＨ细胞形态；Ｄ：接逡逑毒７２邋ｈ的ＬＭＨ细胞形态逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｎｏｒｍａｌ邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌｓ（Ａ）邋ａｎｄ邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＡＲＶ邋ＳＩ邋１３３邋（Ｃ－Ｄ）逦（４００Ｘ）逡逑Ａ：邋Ｎｏｒｎｉａｌ邋ｍｏｒｐｈａ邋ｏｆ邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌ；邋Ｂ：邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈａ邋ａｔ邋ｈｏｕｒ邋２４邋ｐｏｓｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；邋Ｃ：邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈａ邋ａｔ邋ｈｏｕｒ逡逑４８邋ｐｏｓｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；邋Ｄ：邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈａ邋ａｔ邋ｈｏｕｒ邋７２邋ｐｏｓｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ逡逑■■■逡逑图２－２正常NB６１＇0细胞（八）与八１＾／５丨１３３感染的NB￡１＇0细胞（（：－０）逦（４００Ｘ）逡逑Ａ：正常的Ｖｅｒｏ细胞形态；Ｂ：接毒２４ｈ的Ｖｅｒｏ细胞形态；Ｃ：接毒４８ｈ的Ｖｅｒｏ细胞形态；Ｄ：接毒逡逑７２邋ｈ的Ｖｅ
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】