鸡传染性支气管炎病毒山东株分离鉴定及其灭活疫苗制备与评价

发布时间：2020-03-21 07:16

【摘要】：鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是一种有重大经济影响且呈全球分布的家禽疾病。它由鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起,是危害我国养禽业健康养殖的重要疫病。目前已有多种商品化疫苗用于IB的免疫预防,但由于IBV的高变异性、不同血清型之间缺乏交叉保护等原因,IB并未得到有效控制,IBV的综合防控仍然存在着大量难题。鉴于此,本研究对流行病学检测阳性样品进行IBV野毒株分离鉴定及其主要蛋白遗传变异性分析;并基于分离毒株建立IBV快速检测方法,包括荧光定量PCR检测方法和间接ELISA抗体检测方法,利用建立的检测方法对山东地区开展流行病学调查;对分离鉴定的部分毒株进行细胞培养条件的优化,确立最佳培养方法;利用细胞培养的病毒液配制灭活疫苗,探讨灭活疫苗的免疫效果,以期为IBV的早期诊断、流行病学调查、致病机制研究、遗传变异趋势研究、疫苗的制备和检验技术研究奠定基础,为山东地区IBV综合防控措施的制定提供科学依据。为对山东地区疑似IBV感染临床病例进行病原的分离与鉴定,并掌握分离毒株的生物学特性和遗传特征,本研究进行了病毒分离、血凝实验、鸡胚致病性、动物回归等系列试验。结果共获得分离毒株48株,对SPF鸡胚的EID50为10-5.0/0.1m L~10-5.83/0.1 m L,均能引起SPF雏鸡表现典型的IBV感染症状,对SPF雏鸡的致死性介于30%~60%,遗传进化分析显示48株分离毒株中有46株QX基因型,2株Mass基因型,表明QX基因型已成为山东地区IBV流行的优势基因型。基于分离QX基因型毒株建立IBV荧光定量PCR检测方法并组装试剂盒,检测分离毒株的器官嗜性和疫苗攻毒保护试验的排毒量,同时为IBV感染的早期诊断和流行病学调查提供新的检测方法。结果显示:该检测方法的标准曲线线性关系良好,相关系数R2为0.9988,可检测到7.5×103 copies/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;特异性检测结果显示检测MDV、NDV、IBDV、ILTV等其他禽源类病毒均为阴性;批内重复试验和批间重复试验变异系数均小于3%;利用该试剂盒检测192份临床送检病料,检测出阳性样品48份,阳性率达25.0%(48/192),显著高于普通PCR检测方法。以上结果表明IBV Real-time PCR试剂盒敏感性高、特异性强、重复性好,可用于IBV的定量检测和IBV感染的早期诊断和流行病学调查。参照IBV S1基因序列,RT-PCR扩增分离毒株长约867 bp的S1基因主要抗原区域,将其克隆到p ET30α原核表达载体,转化Rossetta表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的IBV重组S1蛋白。在此基础上,将S1重组蛋白经纯化后作为抗原,建立了IBV间接ELISA抗体检测方法并组装了试剂盒,该试剂盒相对于IDEXX ELISA试剂盒的符合率、敏感性、特异性分别为94.55%,95.42%和92.96%,为后续疫苗抗体检测提供了技术支持,同时为临床野毒感染快速诊断和流行病学调查提供新的血清学诊断技术。为了确定分离毒株适于增殖的细胞系,本研究首先将IBV GQ/2015株、WF/2015株、M41株与M491株分别接种Vero、Vero-E6、BHK-21、Macr-145与DF-1细胞,并盲传至F5代,通过EID50的测定,确定最佳细胞系及其最适毒株;在此基础上,对细胞密度、增殖曲线等培养条件、病毒增殖促进剂的作用及小型生物反应器的应用进行了探索。结果显示,5种细胞中,仅Vero细胞适于4株IBV的增殖培养,且GQ/2015株与M491株增殖效果最佳,其毒价分别为10-4.83/0.1 m L与10-4.5/0.1 m L;而Marc-145、BHK-21与DF-1细胞只适于IBV某个毒株的增殖,且其毒价显著低于Vero细胞培养物。另一方面,对GQ/2015株与M491株增殖培养条件的优化的研究显示,GQ/2015株与M491株最适接毒量为细胞培养液的1%、最佳血清浓度为2%、最适接毒方式为分步接毒、最佳收毒时间为60 h~72 h。最后应用固定床纸片载体生物反应器对GQ/2015与M491株进行增殖培养,结果显示,GQ/2015株与M491株的EID50可显著提高至10-6.375/0.1 m L与10-5.83/0.1 m L。因此本研究必将为实现应用细胞系增殖培养IBV的规模化生产提供参考。为开发针对IBV流行毒株的新型疫苗,本研究以IBV GQ/2015株为疫苗株,采用细胞培养方法制备病毒液,以白油为佐剂,研制了IBV油乳剂灭活疫苗,该疫苗安全性好;疫苗免疫0.1 m L和0.3 m L后21 d间接ELISA抗体水平(S/P值)达到峰值,免疫0.5 m L后30 d间接ELISA抗体水平(S/P值)达到峰值;不同分离毒株交叉保护性试验显示该灭活疫苗对当前流行的IBV毒株具有非常好的交叉保护效果。表明IBV GQ/2015株油乳剂灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性,为研发具有自主知识产权的针对流行毒株的IBV疫苗奠定了基础。
【图文】：

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图 1.1 分离毒株鸡胚胚体病变图片Fig3.1 Image separation of embryo somatic lesions in chicken embryoA. GQ/2015 株；B. WF/2015 株；C. LY/2014 株；D. QD/2015 株；6. HZ/2016 株A. GQ/2015 strain；B. WF/2015 strain；C. LY/2014 strain；D. QD/2015 strain；6. HZ/2016 strain1.2.3 分离毒株毒价（EID50）测定结果将48个分离毒株的第6代鸡胚尿囊液用灭菌生理盐水做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-63个稀释度分别接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1mL/胚，37 ℃孵育观察至144 h，，解剖观察鸡胚病变情况，按Reed-Muench法计算分离病毒的EID50，结果如表1.2所示。E

攻毒鸡部分器官病变图片
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】