辽宁地区禽FAdV-4分离鉴定及Hexon基因遗传进化分析

发布时间：2020-03-21 20:50

【摘要】：禽安卡拉病是由Ⅰ群禽腺病毒血清4型(Fowl Adenovirus serotype 4,FAdV-4)引起的一种急性传染病。1987年,该病在巴基斯坦伊斯兰共和国的安卡拉(Ankara)地区首次被报道,因此就被命名为安卡拉病。该病以心包积液和肝脏多灶性坏死为主要病理特征,所以,安卡拉病通常也被称为心包积水-肝炎综合症(Hydropericardium-Hepatitis Syndrome,简称为HHS)。近几年该病正流行于全国各地,对我国养禽业的健康发展造成了很严重的影响。为了更好地了解禽安卡拉病在辽宁地区的分子流行情况,自2016年以来,本实验室采集了辽宁省沈阳、抚顺、鞍山地区疑似FAdV-4感染的11批次病死家禽和野禽的肝脏病料,对其进行阳性检测和Hexon基因的遗传进化分析,试验内容及结果如下:1.根据FAdV-4六邻体蛋白(Hexon)基因设计特异性引物,对疑似患有安卡拉病的家禽和野禽肝脏组织DNA进行PCR扩增后,均在954 bp处出现目的基因片段。通过与GenBank中的参考毒株序列进行遗传进化分析,证实了这些家禽和野禽都感染上了FAdV-4。2.对辽宁省鞍山、抚顺、沈阳的家禽肝脏病料和森林野生动物园的鹫珠鸡肝脏病料按照常规的方法处理后,接种9日龄SPF鸡胚。结果显示,当鸡胚接种7d后解剖均出现生长缓慢、蜷缩等特征。收集SPF鸡胚的尿囊液进行血凝试验,唯有鞍山株SPF鸡胚的尿囊液能够凝集大鼠红细胞。3.根据FAdV-4六邻体蛋白(Hexon)基因设计全基因特异性扩增引物,对辽宁省抚顺、鞍山、沈阳的家禽肝脏病料和森林野生动物园的鹫珠鸡的肝脏病料进行Hexon全基因扩增,结果显示,5份病料均在2889 bp处出现目的条带。本研究课题扩增出的Hexon全基因序列的开放阅读框长度为2814 bp,约编码937个氨基酸,并对Hexon全基因进行系统发育及同源性的分析。本试验分离出的5株分离毒株相互之间的差异与GenBank上已录入的国内参考毒株之间的差异相同,核苷酸同源性在99.8%-100%之间,与国外各国家的参考毒株的核苷酸同源性在96.9%-99.8%之间;与国内参考毒株的氨基酸同源性为99.6%-100%,与国外各国家的参考毒株的氨基酸同源性在96.4%-99.5%之间,说明有很强的保守性。根据系统发育树的结构图可以看出,5株分离毒株与国内的分离毒株都在同一个分支上,而且与国外的印度分离毒株也属于同一个分支,即与印度的毒株相距最近,而与美国的毒株相距最远。4.应用DNASTAR生物信息学软件对六邻体蛋白进行抗原表位的分析与预测,在55-66、162-168、266-275、400-407、560-570、765-774、788-804、874-885和913-919的区段可能是六邻体蛋白潜在的抗原优势表位,而发生氨基酸变异的位点如鹫珠鸡(FAdV-4_Shenyang_Acr.*)毒株中的第406位、鞍山(FAdV-4_Anshan_gallus*)毒株中的第773位和第880位都包含在这些可能潜在的抗原优势表位区域中。通过对Hexon六邻体全基因的克隆与全基因遗传进化分析,了解毒株的变异趋势,对于掌控致病性和毒力都具有非常重要的意义,也为今后深入研讨Ⅰ群禽腺病毒的疫苗奠定理论基础,寻找一种相对优势的抗原对于禽腺病毒的诊断也有很重要的意义。
【图文】：

示意图,粒子结构,腺病毒,示意图

前言DS）相关的一类病毒，能从鹅、鸭、鸡的体内分离而获得大，其中一部分含有Ⅰ群腺病毒的共同抗原（殷震和刘景华1997）。结构及特点囊膜，病毒粒子呈二十面体结构，直径在 80-110 nm 之间 60-65 nm 的髓芯，由排列在三角形面上的 252 个壳粒组成形状。整个病毒粒子含蛋白 87%，含核酸 13%。病毒颗粒，并排列成晶格状。病毒核酸是单分子、线状、双链的 D两端含有 100-140 bp 的末端反向重复序列（ITR）。一般感对分子质量为 20-25×106，G+C 含量为 48%-61%。感染鸟量为 30×106，，G+C 含量为 54%-55%。腺病毒粒子结构如图汇图网。

PCR扩增,抚顺,野禽,斑头雁

均在 954 bp 的片段处出现明亮的核酸特异性条带，与预期大小一致。家禽的 Hexon 基因片段 PCR 扩增结果如图2 所示（抚顺株命名为抚顺 1，抚顺市新宾满族自治县株命名为抚顺 2，下同）；野禽的 Hexon 基因片段 PCR 扩增结果如图 3 所示。图 2 家禽的 Hexon 基因片段 PCR 扩增结果Fig.2 the PCR amplification result of poultry Hexon gene fragment注：M:DL2000 marker 1:抚顺 1 2:抚顺 2 3:沈阳 4:鞍山Note: M:DL2000 marker 1.Fushun1 2:Fushun2 3:Shenyang 4:Anshan图 3 野禽的 Hexon 基因片段 PCR 扩增结果Fig.3 the PCR amplification result of wild fowl Hexon gene fragment注：M:DL2000 marker 1:鹫珠鸡 2:天鹅 3:斑头雁 4:鸵鸟 5:鸽子 6:白孔雀 7:蓝孔雀Note: M:DL2000 marker 1:Acryllium vulturinum 2: Cygnus 3:Anser indicus 4: Struthio camelus5: Columba 6:white peacock 7:blue peahe
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】