传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

发布时间：2020-03-21 18:49

【摘要】：传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病,是严重危害养鸡业的重大传染病之一。IBV是禽类一种变异性很强的冠状病毒,传播迅速、血清型众多,不同的血清型之间缺乏交叉保护。IBV的蔓延对全球家禽业造成了严重的损失。N蛋白是诱导机体免疫应答的重要免疫原蛋白,N基因具有高度的保守性。本研究以IBV N蛋白为研究对象,制备了针对N蛋白的单克隆抗体,对IBV的预防、诊断及控制具有一定的意义。本实验将IBV H120毒株通过接种鸡胚的方法扩繁,从含病毒的尿囊液中提取总RNA,反转录为cDNA。设计一对特异性引物对N基因进行扩增,片段大小为1230bp,将其与克隆载体pMD19-T连接并转入DH5α感受态细胞并保存菌种,将其与表达载体pGEX-6p-1连接并转入Transetta(DE3)感受态细胞,进行诱导表达。SDS-PAGE电泳分析重组N蛋白大小约为79kD,用GST柱纯化重组N蛋白,加入PreScission Protease切除GST标签,Western-blot检测N蛋白的抗原性,结果显示N蛋白有较好的抗原性。采用纯化的N蛋白对BALB/c小鼠进行免疫,通过间接ELISA方法检测,选取免疫效果最好的小鼠B淋巴细胞进行细胞融合。通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过三轮亚克隆获得了13株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,其中8株能与IBV结合。选择效价高且能与IBV结合的1A12C5细胞株,通过小鼠体内诱生腹水法大量制备抗N蛋白的单克隆抗体,收集腹水用正辛酸-硫酸铵法对其进行纯化,SDS-PAGE电泳结果表明该单抗纯度比较高。1A12C5单克隆抗体重链为IgG2b,轻链κ型。纯化后的1A12C5单抗效价可以达到1:1.64×10~6,亲和力常数为1.87×10~7 L/mol。特异性鉴定结果表明1A12C5仅与IBV特异性结合。1A12C5单克隆抗体能与不同血清型的IBV反应。稳定性鉴定表明1A12C5单克隆抗体具有良好的传代稳定性。本试验成功制备了13株抗IBV N蛋白单克隆抗体其中8株可以与IBV结合,为进一步研制IBV诊断试剂奠定了基础。
【图文】：

图 1.1 OIE 公布的 IBV 全球分布图BV 的病原学概述IBV 的分类地位V 是套式病毒目(Nidovriales)冠状病毒科(Coronavridae)冠状病毒亚科(virinae)γ 冠状病毒属(Coronavrius)成员[12]。冠状病毒科包含凸隆病毒属毒属，根据血清学和遗传学的差异能够把冠状病毒属划为三个群，IBV群的禽冠状病毒的代表成员[13, 14]。IBV 的结构特征V 主要包含囊膜以及核衣壳。囊膜为脂质双分子层，位于病毒的最外面由宿主细胞的内膜系统中的糙面内质网膜或高尔基体膜组成的。IBV 是的，由单股的正链 RNA 组成基因组，总长大概是 27.6kb[15]。病毒体为螺旋对称，半径大约为 40~60nm。IBV 内部是蛋白质以及 RNA 构成螺

图 1.2 IBV 结构模式图特征环境抵抗力较弱，大部分毒株在 56℃条去活性，，可以通过 20%马血清或者 lm。不同毒株可能有一定差异，2M MgCl2不耐碱耐酸，于pH6.0~6.5环境进行培养性[17]。组织被病毒感染后可以在含 50%冻就能够送到相关实验室检测诊断。含℃~-80℃条件下保存多年 IBV 依然可以以及干燥有稳定效果，冻干毒能够在低特性有血凝性，但是通过一些处理会导致血
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】

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本文编号：2593774