鸡表皮生长因子在乳酸乳球菌中的表达及初步应用

发布时间：2020-03-22 14:41

【摘要】：表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)是一种能够促进细胞增殖、分化的小分子多肽,在动物机体内一系列的生理过程中扮演重要的角色。人们在研究哺乳动物的EGF时发现其可影响动物的生长性能、免疫功能及肠道发育,但是目前有关鸡表皮生长因子(gallus epidermal growth factor,gEGF)的研究却很少有提及,而雏鸡抵抗力较弱,其生长发育易受到不良条件的影响,因此本试验拟采用乳酸乳球菌非抗性筛选表达系统进行外源表达gEGF,并通过体内外试验对其生物学功能进行初步研究。以下是研究内容及结果。人工合成SP_(usp45)和gEGF融合基因片段,将此目的基因克隆至表达载体pNZ8149,之后电转化至乳酸乳球菌NZ3900,获得了能够分泌表达gEGF的工程菌LL-pNZ8149-gEGF,重组工程菌经Nisin诱导后,利用Western blot和SDS-PAGE检测到菌体和上清中表达的蛋白,此外,还利用HisTrap柱成功从上清中纯化出gEGF蛋白。体外培养鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1至单层细胞的60%左右后饥饿培养12 h,之后以不同浓度的gEGF蛋白溶液分别刺激UMNSAH/DF-1细胞,观察gEGF对UMNSAH/DF-1细胞的增殖活性的影响。结果发现,1-10μg/mL gEGF均可显著促进UMNSAH/DF-1细胞的增殖,5μg/mL gEGF的促进作用最强。以5 d龄雏鸡作为试验动物,将其分为3组,每组每日分别灌服1ml M17培养基、LL-pNZ8149诱导上清液、LL-pNZ8149-gEGF诱导上清液,连续灌服2周,记录每天的采食量、体重,计算1周及2周内平均日采食量、平均日增重以及料肉比,以此作为评价gEGF对肉鸡生长性能影响的依据,结果发现:gEGF可显著提高肉鸡末重、平均日增重、平均日采食量以及2周内的料肉比;2周后处死鸡群,取出免疫器官脾脏、胸腺、法氏囊,计算免疫器官指数,翅静脉采血检测血清IgG、IgA水平,之后分别刮取十二指肠、空肠、回肠黏膜测定黏膜sIgA水平,以此作为评价gEGF对肉鸡免疫功能影响的依据,结果发现:gEGF可显著提高胸腺、脾脏指数以及血清IgG、IgA以及十二指肠黏膜sIgA水平;此外,2周后分别取十二指肠、空肠、回肠组织制作组织切片,分析各肠段绒毛高度,隐窝深度的变化,以此作为评价gEGF对肉鸡肠道发育影响的依据,结果发现:gEGF可显著提高十二指肠,空肠绒毛高度,降低十二指肠隐窝深度。本试验成功实现了gEGF在乳酸乳球菌非抗性筛选表达系统的表达,所表达的产物具有促进UMNSAH/DF-1细胞增殖的活性,动物实验表明,gEGF具有改善肉鸡的生长性能,提高免疫功能以及促进肠道发育的作用。
【图文】：

鸡表皮生长因子在乳酸乳球菌中的表达及初步应用生长因子（epidermal growth factor, EGF）（图 1）是一种促小分子多肽，Cohen 等最先从小鼠颌下腺中发现并分离得 mEGF），之后测定其一级结构序列后发现，mEGF 是由 5约为 6k Da 左右，由于其中含有 3 对二硫键，因此其对酸Cohen et el 1962）。除促进细胞的增殖、分化外，EGF 还胃液的分泌、调节胚胎的发育以及参与内分泌系统功能的表明肿瘤的发生也与 EGF 有关。由于 EGF 在机体内具有的应用前景，EGF 正受到人们越来越多的关注。

华中农业大学 2019 届硕士研究生学位（毕业）论文要分布于上皮细胞，包含 3 部分：细胞膜外结构域、跨膜区和细胞内区域，其胞膜外结构域含有多对二硫键，EGF 可与之结合（Carpenter et al 1990）。 EGFR 的细胞膜外结构域结合后，使得 EGFR 构象发生变化，形成二聚体复合起 EGFR 胞内区末端的酪氨酸残基磷酸化，从而激活一系列下游信号通路（图信号传入核内，促进 DNA 和蛋白质的合成，，从而促进细胞生长增殖（Marqu1999），在这之后，信号被灭活，二聚体复合物降解或转移至细胞表面（Sebaal 2006）。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S831

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本文编号：2595187