毒害艾美耳球虫早熟株选育及Engam59基因原核表达与免疫保护力研究

发布时间：2020-03-22 16:43

【摘要】：鸡球虫病是一种严重危害养鸡业的寄生原虫病,该病的防治主要采用在饲料中添加化学药物和疫苗免疫预防两种方法。目前在临床上应用的鸡球虫病疫苗包括活疫苗和亚单位疫苗两大类。活疫苗又包括毒疫苗和弱毒疫苗两大类,由于弱毒疫苗的虫株毒力低,免疫后不引起不良反应或反应轻,所以更受养殖户青睐。亚单位疫苗的生产需从感染的鸡体内分离纯化配子体,然后再用亲和柱层析的方法分离纯化配子体蛋白,因此生产费时、成本昂贵。利用基因重组技术研制基因工程疫苗可能解决这一难题。毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)是鸡球虫病的重要病原,在临床上常危害8～18周龄的鸡,引起鸡的急性小肠球虫病。近年来,在我国随着生长周期较长的黄羽鸡饲养数量的不断攀升,以及采用地面平养方式,使得由毒害艾美耳球虫引起的球虫病呈上升趋势,给养鸡业带来很大的经济损失。为此,本研究采用早熟选育的方法培育毒害艾美耳球虫减毒株,同时应用基因工程技术原核表达毒害艾美耳球虫配子体蛋白Engam59基因,纯化表达产物,进行动物免疫保护试验,评价重组配子体抗原的免疫保护力以及早熟株的免疫原性,旨在为鸡球虫病减毒疫苗和基因工程疫苗的研制奠定基础。1毒害艾美耳球虫单卵囊虫株的建立其PCR鉴定分离毒害艾美耳球虫单个卵囊,感染3日龄无球虫雏鸡,收集鸡粪便中卵囊,培养孢子化后感染雏鸡扩增卵囊;卵囊孢子化后再感染无球虫雏鸡,观察肠道病变、虫体寄生部位以及卵囊形态。以4种鸡球虫实验室保存株(毒害、巨型、柔嫩、堆型艾美耳球虫)的基因组DNA为模板,分别用针对4种球虫的ITS-1序列设计的种特异性引物进行PCR扩增,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察特异性条带。根据肠道病变、虫体寄生部位和卵囊形态特征,鉴定单卵囊分离株为毒害艾美耳球虫,其潜在期为156 h。PCR结果显示,只有在模板和扩增引物为同一种球虫时,方能扩增出特异性条带,表明本室保存的4种鸡球虫均为纯种株。2毒害艾美耳球虫的早熟株选育以毒害艾美耳球虫单卵囊分离株为亲本株,采用早熟株选育方法选育毒害艾美耳球虫早熟株。经26代早熟选育后,再连续传代2次,扩增卵囊。扩增卵囊培养孢子化后,以0.5 × 104、1 × 104、3 × 104、5 × 104个/羽的剂量感染14日龄雏鸡,同时设亲本株为对照组,以平均体重、死亡率和肠道病变记分为指标,评价早熟株的致病性。结果显示,经26代早熟选育后潜在期从156h缩短到140h,早熟株与亲本株相比致病性明显减弱。3毒害艾美耳球虫配子体Engam59基因的原核表达根据Engam59基因的ORF序列和质粒pET-28a(+)酶切位点设计引物,以重组质粒pGEM-T-Easy-gam59为模板扩增出表达片段,大小为1419 bp(已除掉信号肽部分)。将该基因片段与载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a(+)-gam59。重组质粒pET-28a(+)-gam59转化BL21,诱导表达。融合蛋白经SDS-PAGE分析显示大小为57 kDa左右,Western blot分析显示重组蛋白能被抗6 × HIS标签单抗特异性识别。可溶性分析显示重组蛋白以包涵体存在。用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多抗,以制备的抗重组蛋白鼠多抗为一抗,Western blot检测毒害艾美耳球虫配子体蛋白,见有一大小为56kDa左右的特异性条带。结果表明体外重组表达配子体蛋白rEnGAM59具有较好的免疫原性。4毒害艾美耳球虫重组配子体蛋白rEnGAM59的免疫保护效果以雏鸡为试验动物,卵囊减少率、病变记分、平均增重等为指标,评价重组蛋白rEnGAM59的免疫保护效果,并检测免疫后产生的特异性抗体水平。结果显示,与未免疫攻虫组相比,重组蛋白rEnGAM59在一定程度上能降低卵囊产量与减轻病变记分,提高平均增重,但不能达到卵囊免疫组的免疫保护水平。早熟株卵囊免疫组与亲本株卵囊免疫组的免疫保护效果相近,无显著差异。
【图文】：

卵囊,单卵囊,孢子囊

３结果逡逑３．邋１单卵囊分离株的卵囊形态逡逑卵囊呈长卵圆形，壁光滑，，无卵膜孔和卵囊残体，有极体（图１－１）。测１００个孢子逡逑化卵囊，大小为邋１２．５０邋￣邋３０．００邋ｐｍ邋ｘ邋１２．５０邋￣邋２２．５０邋（ａｍ，平均大小为邋１７．５０邋ｎｍ邋ｘ邋１４．５５逡逑形状指数为１．２０。孢子囊呈长卵圆形，有斯氏体，无孢子囊残余体，测１００个孢子囊大小逡逑为邋９．００？１４．００叫１＞＜４．００？７．１０｜ａｍ，平均大小邋ｉａ９１（ａｍｘ５．９１ｐｍ，与文献相符［１’５］。逡逑＿逡逑图１－１毒害艾美耳球虫卵囊逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｏｏｃｙｓｔｓ邋ｏｆ邋Ｅ．邋ｎｅｃａｔｒｉｘ逡逑３．邋２单卵囊分离株的潜在期逡逑攻虫后第５天开始进行粪检，每隔２邋ｈ进行一次。在１５６邋ｈ查见卵囊排出，故该毒害逡逑艾美耳球虫的潜在期为１５６小时。逡逑３．邋３单卵囊分离株的寄生部位和肠道病变逡逑剖检感染鸡，发现整个小肠，尤其是卵黄蒂前后，浆膜面可见针尖状出血点，肠管明逡逑显肿胀（图１－２），打开肠腔见肠内容物混有较多血凝块，肠黏膜脱落，刮取肠黏膜涂片逡逑镜检发现大量的巨型裂殖体，卵囊仅见于盲肠黏膜中。逡逑

柔嫩艾美耳球虫,引物,条带,特异性

ｃ：邋Ｅ．邋ｍａｘｉｍａ邋ｓｐｏｒａｔｅｄ邋ｏｏｃｙｓｔｓ；邋ｄ：邋Ｅ．邋ａｃｅｎ＾ｕｌｉｎａ邋ｓｐｏｒｕｌａｔｅｄ邋ｏｏｃｙｓｔｓ逡逑３．邋３邋ＰＣＲ产物电泳检测逡逑ＰＣＲ产物的电泳检测结果见图１－４￣７。以毒害艾美耳球虫的ＤＮＡ为模板，分别用毒逡逑害、柔嫩、巨型和堆型艾美耳球虫的引物进行ＰＣＲ扩增，结果仅在用毒害艾美耳球虫引逡逑物进行ＰＣＲ扩增的产物中见有特异性条带，其他３种球虫的引物未能扩增出条带。而当逡逑以柔嫩艾美耳球虫的ＤＮＡ模板时，用柔嫩艾美耳球虫引物进行ＰＣＲ扩增可见有特异性逡逑条带（图１－４）。逡逑以柔嫩艾美耳球虫的ＤＮＡ为模板，分别用柔嫩、巨型、堆型和毒害艾美耳球虫的引逡逑物进行ＰＣＲ扩增，结果仅在用柔嫩艾美耳球虫引物进行ＰＣＲ扩增的产物中见有特异性条逡逑带，其他３种球虫的引物未能扩增出条带。而当以毒害艾美耳球虫的ＤＮＡ模板时，用毒逡逑害艾美耳球虫引物进行ＰＣＲ扩增可见有特异性条带（图卜５）。逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.723

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