抵抗素与脂多糖对猪肺泡巨噬细胞炎性细胞因子的表达调控及分子机制研究

发布时间：2020-03-23 04:18

【摘要】：猪传染性胸膜肺炎由胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)引起,是严重危害我国养猪业健康发展的重要疫病之一。近年研究发现,造成胸膜肺炎严重肺损伤的主要病理学机制是由A.pleuropneumoniae或A.pleuropneumoniae LPS引起猪肺泡巨噬细胞(PAMs)促炎因子释放失控所致,但具体机制尚不清楚。人工感染A.pleuropneumoniae猪的肺部及肺门淋巴结中炎性细胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α等的表达均显著上调,而抵抗素的表达也显著上调。有研究表明,抵抗素能通过TLR4/NF-κB信号通路促进单核巨噬细胞释放炎性细胞因子;同样TLR4/NF-κB信号通路也是革兰氏阴性菌LPS激活炎症细胞的重要途径;而PAMs又是肺部最早接触病原微生物的防御细胞之一,在防止病原入侵及在肺部促炎和抑炎中均发挥重要作用。因此,试验基于TLR4/NF-κB信号通路,研究A.pleuropneumoniae LPS、抵抗素对PAMs释放IL-1β、IL-6和TNF-α的作用机制。试验一A.pleuropneumoniae LPS经TLR4/NF-κB通路诱导猪肺泡巨噬细胞表达炎性细胞因子以终浓度为0 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL和1000 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS与PAMs作用6 h,采集细胞上清及下层细胞,待检。以终浓度为100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS与PAMs分别作用0 h、1.5 h、3 h、6 h和12 h,采集各时间点的细胞上清及下层细胞,待检。利用ELISA检测细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的蛋白浓度;qRT-PCR检测下层细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的mRNA表达水平。用终浓度为150 nmol/L的TLR4-siRNA、MyD88-siRNA和TRAM-siRNA分别与增殖达培养孔底部面积约70%的PAMs作用48 h后,以终浓度为100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS与PAMs作用6 h,采集细胞上清及下层细胞,其中细胞上清检测IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的蛋白浓度,下层细胞检测TLR4、MyD88、TRAM、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的mRNA表达水平。用终浓度为5μmol/L的Bay11-7082与铺满单层的PAMs作用2 h后,以终浓度为100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS与PAMs作用6 h,采集细胞上清及下层细胞检测IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的蛋白浓度及其mRNA表达水平。结果:本试验中,不同浓度的A.pleuropneumoniae LPS作用PAMs 6 h或者终浓度为100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS与PAMs作用不同时间,均能提高PAMs中IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的mRNA表达水平以及上清中的蛋白浓度。终浓度为1000 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS作用6 h后会致使PAMs病变,影响细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的表达。siRNA和Bay11-7082分别作用PAMs后,由A.pleuropneumoniae LPS诱导IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的表达均显著降低(P0.05)。上述结果表明,A.pleuropneumoniae LPS促进PAMs中IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的释放,与其上调PAMs中TLR4、MyD88、TRAM、NF-κB等基因的表达有关。试验二抵抗素经TLR4/NF-κB通路诱导猪肺泡巨噬细胞表达炎性细胞因子以终浓度为0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL的抵抗素与PAMs作用6 h,采集细胞上清及下层细胞(指标检测及方法参考试验一)。以终浓度为10 ng/mL的抵抗素与PAMs分别作用0 h、1.5 h、3 h、6 h、12 h和24 h,采集各时间点的细胞上清及下层细胞(指标检测及方法参考试验一)。用终浓度为150 nmol/L的TLR4-siRNA、MyD88-siRNA和TRAM-siRNA分别与增殖达培养孔底部面积约70%的PAMs作用48 h后,以终浓度为10 ng/mL的抵抗素与PAMs作用6 h,采集细胞上清及下层细胞(指标检测及方法参考试验一)。用终浓度为5μmol/L的Bay11-7082与铺满单层的PAMs作用2 h后,以终浓度为10 ng/mL的抵抗素与PAMs作用6 h,采集细胞上清及下层细胞(指标检测及方法参考试验一)。结果:本试验中,不同浓度的抵抗素作用PAMs 6 h或者终浓度为10 ng/mL的抵抗素与PAMs作用不同时间,均能提高PAMs中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平以及上清中的蛋白浓度。siRNA和Bay11-7082分别作用PAMs后,由抵抗素诱导IL-1β、IL-6和TNF-α的表达均显著降低(P0.05)。上述结果表明,抵抗素促进PAMs中IL-1β、IL-6和TNF-α的释放,与其上调PAMs中TLR4/NF-κB通路基因的表达有关。试验三抵抗素与A.pleuropneumoniae LPS竞争性作用于猪肺泡巨噬细胞TLR4/NF-κB通路试验用终浓度1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL的抵抗素与PAMs作用2 h后,用终浓度100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS继续作用12 h,采集细胞上清及下层细胞,检测相应指标。用终浓度为150 nmol/L的TLR4-siRNA、MyD88-siRNA和TRAM-siRNA分别与增殖达培养孔底部面积约70%的PAMs作用48 h后,以终浓度为10 ng/mL的抵抗素与PAMs作用2 h后,用终浓度为100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS继续作用12 h后,采集细胞上清及下层细胞,检测相应指标。用终浓度为5μmol/L的Bay11-7082与铺满单层的PAMs作用2 h后,以终浓度10ng/mL的抵抗素与PAMs作用2 h后,用终浓度100 ng/mL的A.pleuropneumoniae LPS继续作用12 h后,采集细胞上清及下层细胞,检测相应指标。结果:本试验中,不同浓度的抵抗素作用PAMs后,由A.pleuropneumoniae LPS诱导IL-1β、IL-6和TNF-α的表达均显著降低(P0.05)。siRNA和Bay11-7082分别作用PAMs后,由抵抗素与A.pleuropneumoniae LPS共同诱导IL-1β、IL-6和TNF-α的表达均显著降低(P0.05)。上述结果表明,抵抗素竞争性抑制A.pleuropneumoniae LPS对PAMs中IL-1β、IL-6和TNF-α的释放,与其下调A.pleuropneumoniae LPS对PAMs中TLR4、MyD88、TRAM、NF-κB等基因的表达有关。结论:1.A.pleuropneumoniae LPS具有促进PAMs释放炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和抵抗素的作用;其作用机制与A.pleuropneumoniae LPS上调PAMs细胞中TLR4、MyD88、TRAM和NF-κB的表达有关。2.抵抗素具有促进PAMs释放炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的作用;其作用机制与抵抗素上调PAMs细胞中TLR4/NF-κB通路基因的表达有关。3.抵抗素具有抑制由A.pleuropneumoniae LPS刺激PAMs释放炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的作用;其作用过程与抵抗素竞争性抑制PAMs细胞中TLR4、MyD88、TRAM和NF-κB的表达有关。
【图文】：

过程、孕酮介导卵母细胞成熟过程以及类固醇激素生物合成过程等 8 个信号通联基因组富集效果显著(P< 0.05)。在肺门淋巴结中，感染 A. pleuropneumoniae致 104 个信号通路关联基因组上调，血管内皮生长因子和神经营养因子信号通联基因组富集效果显著(P< 0.05)。感染 A. pleuropneumoniae 导致了猪肺脏和肺巴结大量基因的表达谱发生显著和/或极显著地变化，其结果说明了机体受到感自发启动免疫与能量代谢通路并刺激关联基因组的表达，进而调动免疫细胞发菌和抗感染功能；与此同时，，结果还显示了受感染的肺组织和淋巴结中与炎症有关的部分基因表达量显著下调(P< 0.05)，这可能与机体调节炎症过度反应有关.2.5.2 A. pleuropneumoniae急性感染对猪肺部TLR4信号通路的影响上述基因芯片研究同时显示人工感染 A. pleuropneumoniae 会激活猪肺部及肺巴结中 Toll 样受体(Toll like receptors, TLRs)信号通路，并且导致炎性细胞因子-1、IL-6、TNF-α 以及抵抗素基因 mRNA 表达显著上调[52]。

31图 2-1 A. pleuropneumoniae 血清 1 型脂多糖 SDS-PAGE 电泳图（硝酸银染色）Fig.2-1 Silver-stained SDS-PAGE profile of LPS from A. pleuropneumoniae serotype 1泳道 1 为蛋白 marker；泳道 2~4 为 A. pleuropneumoniae LPS；泳道 5 为 PBS 空白对照显示 A. pleuropneumoniae LPS 由 O-antigen、core 和 lipid A 三部分组成。图左侧标记分 kilodaltons, KDa)，泳道 2-4 每孔上样量为 8 μg A. pleuropneumoniae LPS。Lane 1 for protein marker; Lane 2-4 for A. pleuropneumoniae LPS; Lane 5 for blank contr This gel showed that purified A. pleuropneumoniae LPS were composed of O-antigen, coA. Molecular mass markers (in kilodaltons) were indicated on the left. 8 μg A. pleuropneumsamples were loaded in Lane 2-4.
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4

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本文编号：2596168