表达外源基因的重组鸭坦布苏病毒的构建与稳定性研究

发布时间：2020-03-23 10:44

【摘要】：自2010年以来,新发鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)病在我国广泛流行,给我国的养鸭业造成了巨大的经济损失。本研究拟利用弱毒疫苗株(FX2010-180P)建立的反向遗传操作系统,探索在该致弱毒株基因组的不同位置插入报告基因,找到一处能够表达外源蛋白的插入位点,为以后新型疫苗的研发奠定基础。为了探究DTMUV是否能够稳定表达外源蛋白,利用融合PCR等方法,在DTMUV基因组的5’非编码区(UTR)与C基因、C基因与PrM基因、PrM基因与E基因、E基因与NS1基因之间分别插入绿色荧光蛋白基因(EGFP),并在基因之间插入表达口蹄疫2A蛋白的序列;在NS5基因与3’UTR之间插入内部核糖体引入位点(IRES)与EGFP,进而获得5’端含有启动子、外源基因序列的FX2010-180P株全长cDNA。然后以此为模板进行体外转录,得到具有感染性的RNA,将其转染至DF-1细胞4d后,只有NS5基因与3’UTR之间插入外源基因的转染孔出现了表达绿色荧光蛋白的重组DTMUV。将重组病毒连续传代,发现随着传代次数的增加荧光强度逐渐减弱,传至P5代荧光完全消失。测序结果显示,重组病毒不仅丢失了IRES 3’端506个核苷酸以及整个EGFP,而且还丢失了FX2010-180P株3’端紧挨着终止密码子的67个核苷酸。鉴于此,我们人为缺失这67个核苷酸,同时插入IRES与EGFP,同样方法进行重组病毒拯救,发现病毒能够增殖并且产生与亲代毒相似的细胞病变,传至第5代后荧光逐渐减弱,P7代后荧光完全消失,说明缺失这67个核苷酸的重组病毒依旧不能稳定表达外源蛋白。通过高通量测序发现,P2代重组病毒中至少含有12种不同长度序列缺失的病毒,缺失位置也不一致,每个位置丢失序列的长度也不尽相同。继续传代后发现细胞上清中重组病毒种类逐渐减少,最后以一种或者几种比较优势的状态存在。本研究证明在NS5基因与3’UTR之间虽然能够插入并表达外源基因,但是传代后不稳定;本研究获得一系列序列缺失病毒,为研究黄病毒基因稳定性的分子机制提供了素材,为构建稳定表达外源基因的病毒载体奠定了基础。
【图文】：

黄病毒,病毒粒子,结构示意图

表达外源基因的重组鸭坦布苏病毒的构建与稳定性研究寻找可以稳定表达报告基因的插入位点，为新型疫苗的研制奠定基础。TMUV 分子生物学特性TMUV 形态结构MUV 和其它黄病毒属病毒一样，病毒呈球形，直径在 40-50nm 之间(Y成熟病毒粒子被表面镶有糖蛋白棘突的双层磷脂分子层的囊膜包裹，囊体对称的核衣壳蛋白，其中含有 DTMUV 基因组 RNA(Liu et al., 2013)

基因组结构

图 2 DTMUV 的基因组结构（Konstantin V. Pugachev et al., 2003）Fig. 2 The genome structure of Flavivirus（Konstantin V. Pugachev et al., 2003）研究发现，黄病毒具有包膜，当病毒入侵细胞时，包膜可与被感染细胞的细胞合，形成内涵体，随后病毒囊膜和内涵体融合，将 RNA 导入宿主细胞，即通过这种体内吞”机制将自身遗传信息植入被感染细胞的细胞质中，如图 3。病毒 RNA 被释细胞质后，除了以正链 RNA 为模板合成负链 RNA 之外，，还具有 mRNA 功能，编聚蛋白前体，随后被切割成结构蛋白和非结构蛋白。在病毒包膜与宿主细胞膜融合中，一种叫做“融合蛋白”的物质起着至关重要的作用，而且该物质对宿主细胞质的程度比较敏感，宿主细胞质的酸性程度越高越有利于病毒的入侵。随后，结构蛋白和 E 在内质网腔内形成稳定的异源二聚体，同时 C 蛋白和病毒基因组装配后与异源体复合物结合形成不成熟的病毒粒子，进而被转运到细胞内反面高尔基体网上，在蛋白酶的作用下，形成成熟完整的病毒粒子，分泌到细胞外(Mukhopadhyay and Rossm2005)。结构蛋白和非结构蛋白在病毒发挥功能方面有着不一样的功能，结构蛋白主
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

【参考文献】