let-7b通过靶向Penk1基因调控大鼠电针耐受

发布时间：2020-03-23 14:44

【摘要】：电针镇痛是20世纪针灸科学中最重要的原创性成果,由于其安全、生理干扰少和经济等特点,被广泛应用于外科手术止痛和疼痛疾病的治疗。现代神经生物学研究证实电针镇痛是由神经和体液共同参与的生理性调节过程,早期研究发现中枢神经系统的多种神经递质参与了镇痛调节,后期研究发现一些神经调质,尤其是内源性阿片肽,在电针镇痛中发挥了更为重要的作用。电针具有良好的镇痛效应,然而单次长时间或者短时间内多次电针,易引起针刺镇痛效应的快速下降,产生电针耐受,有关电针耐受的研究主要集中在阿片肽、抗阿片肽以及它们的受体之上。MiRNA已被确定参与吗啡耐受,而慢性电针耐受和吗啡耐受存在着交叉耐受,根据两者的相关性,本实验室最新的研究发现miRNA(包括let-7b)也参与了电针耐受,因此,进一步探讨miRNA参与电针耐受的蛋白机制,有助于寻找解决电针耐受的有效方法,降低其不利影响,促进针刺技术的推广应用。MiRNA能够与靶基因3'UTR通过碱基互补配对,造成靶基因翻译受到干扰,进而造成一定的生物学效应。利用靶基因预测软件发现Penk1可能是参与电针耐受的let-7b的靶基因,Penk1可以翻译前脑啡肽蛋白,经酶解后产生脑啡肽。脑啡肽是中枢神经系统中含量最丰富的阿片肽物质,广泛分布于整个中枢神经系统,大量研究表明脑啡肽在电针镇痛中发挥了重要的作用,而let-7b能否通过干扰Penk1基因翻译表达来影响电针镇痛效果,引起电针耐受还未被证实。通过体外培养大鼠下丘脑神经元细胞并构建靶基因双荧光素酶报告质粒进行共转染,结果表明,let-7b可以显著抑制WT-psiCHECK2-Penk1-3'UTR双荧光素酶报告质粒荧光信号,证明Penk1是let-7b的靶基因。为了确定let-7b在电针耐受大鼠体内也参与对Penk1基因的调控,采用72只雌性SD大鼠,随机分成4组,分别为EA+AgoNC组、EA+AtgNC组、EA+Ago组和EA+Atg组,每组18只,对所有大鼠构建侧脑室注射模型。电针前1d对4组实验动物分别注射stable negative control(agomir空白对照)、miRNA inhibitor NC(antagomir空白对照)、agomir-let-7b和antagomir-let-7b,并在大鼠右后趾构建CFA炎症病理模型。以2/15Hz频率,每日在大鼠双侧“足三里-三阴交”穴位电针30min,连续7d。每次电针前后测定大鼠鼠尾痛阈,计算痛阈变化率,并于各组1d、4d和7d电针后2h随机挑选6只大鼠,取下丘脑,通过westernblot方法检测PENK的蛋白表达水平,并采用qPCR方法检测let-7b的表达变化。结果显示:电针第1d EA+Ago组与其它各组相比痛阈变化率显著降低(p0.05);而在电针第7d EA+Atg组与其它各组相比痛阈变化率显著升高(p0.05),表明let-7b可以影响CFA炎症电针大鼠痛阈变化;EA+AgoNC组let-7b表达量结果显示,电针7d后较第1d电针后let-7b表达显著升高(p0.05);蛋白结果显示,电针第1d EA+Ago组与其它实验组相比PENK蛋白水平显著降低(p0.05),而在电针第7d EA+Atg组与其它组相比PENK蛋白水平显著升高(p0.05),表明let-7b可以影响电针后PENK的表达变化。本实验在体外通过双荧光素酶报告质粒,体内通过鼠尾痛阈变化率和PENK蛋白表达变化,确定了在下丘脑中,let-7b可通过靶向Penk1基因调控大鼠电针耐受,该结果在蛋白水平进一步阐明了miRNA参与电针耐受的分子机制。
【图文】：

let-7b 通过靶向 Penk1 基因调控大鼠电针耐受b-5p 靶基因预测与验证基因预测以及预测靶基因 3’UTR 双荧光素酶报告载体验采用 miRNAwalk（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zm-self.html），，预测出潜在的靶基因 495 个（部分预测结果见附表选出 Penk1 基因作为后续实验的目的基因。本实验使用 psiCHE 2-1），构建 Penk1-3’UTR 双荧光素酶报告载体及其突变体的构

图 2-1 大鼠足三里穴（ST36）、三阴交穴（SP6）（来源于华兴邦等，1991）Fig. 2-1 The acupoints of “Zusanli” (ST36) and “Sanyinjiao” (SP6) in rats.(Hua Xingbang et al 1991)2.7 大鼠痛阈变化率测定采用鼠尾热辐射测痛法进行痛阈测定(任民峰 and 韩济生 1978)。轻柔地将大鼠置于保定筒内，固定于鼠尾热辐射测痛仪的支架上，将鼠尾自然平放并等分为 6 段。在自尾跟起第四段做标记，用于光照测痛。将鼠尾标记点对准并紧贴光照点，记录自光照开始至大鼠产生甩尾反应的时间。正式实验前，先调整发光灯泡功率，使室温下 4~6 s 引起多数大鼠的甩尾反应作为适宜刺激强度。为避免长期光照造成烫伤，设置 15 s 为大鼠甩尾反应阈的上限，超过这一限度即停止照射。电针前测定 3 次大鼠 TFL，每次间隔 5 min，取平均值作为该大鼠的基础痛阈（电针前 TFL）。电针后测定 3 次大鼠 TFL，每次间隔 5 min，取 3 次测定平均值作为电针后痛阈。以 Δn 表
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S853.6

【参考文献】

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本文编号：2596871