亚洲带绦虫外泌体的分离鉴定及其对LoVo细胞的影响
发布时间：2020-03-25 04:25
【摘要】：亚洲带绦虫(Taenia asiatica)是一种重要的人畜共患寄生虫,成虫寄生于人体肠道,幼虫(囊尾蚴)主要寄生于猪肝脏和肌肉。亚洲带绦虫广泛分布于亚洲各国,对人体健康和公共卫生安全造成潜在危害。外泌体(Exosome)作为细胞分泌的一种新型的囊泡型通讯载体,可转运细胞或寄生虫等病原相关分子至受体细胞中,从而调控宿主的免疫应答及炎性反应,逃避宿主的免疫监视。目前,尚未见有关亚洲带绦虫感染和免疫机理的报道,但推测其外泌体在虫体与宿主小肠上皮细胞相互作用方面中发挥着重要作用。因此,本论文主要研究了亚洲带绦虫外泌体的分子特征,及其对终末宿主肠上皮细胞的影响。通过形态学观察和线粒体CoxI及Cytb基因序列分析,将获得的虫体鉴定为亚洲带绦虫。体外培养亚洲带绦虫并收集其分泌排泄产物,采用差速离心法分离纯化亚洲带绦虫外泌体。通过电镜观察和粒径分析证明,纯化的囊泡符合外泌体形态特征,说明成功获得了亚洲带绦虫外泌体。利用蛋白质谱及小RNA高通量测序技术分别分析外泌体所携带的蛋白质及miRNA。结果表明,外泌体共携带455种虫体蛋白,其中包含高丰度的代谢酶。免疫电镜证明,烯醇化酶和14-3-3蛋白存在于外泌体中。小RNA测序分析发现,外泌体中包含20个已知miRNA和5个新miRNA(reads300),RT-qPCR对外泌体和亚洲带绦虫成节中的9个miRNA进行验证,结果发现外泌体中9个miRNA的相对丰度与小RNA测序结果基本一致,但外泌体对虫体中不同的miRNA具有明显的选择性。miRNA靶基因预测及分析发现,大量靶基因参与调节细胞自噬和细胞增殖。进一步研究亚洲带绦虫外泌体对人结肠癌(LoVo)细胞的影响。结果发现,PKH67绿色荧光染料标记的外泌体可被LoVo细胞主动摄入。分别用表达Ad-mCherry-GFP-LC3B和Ad-mCherry-p62的重组腺病毒接种外泌体处理的LoVo细胞,激光共聚焦检测发现,外泌体处理组的细胞自噬被抑制。Western blotting检测自噬标志分子LC3B-Ⅱ、Beclin I和P62的表达水平,也显示外泌体可抑制LoVo细胞自噬。同时还发现,外泌体处理细胞的pAMPK/AMPK(p0.01)显著降低,说明外泌体可能通过AMPK信号通路抑制细胞自噬。为明确亚洲带绦虫外泌体对LoVo细胞增殖和炎症因子分泌的影响,首先用CCK8试剂盒检测外泌体处理的LoVo细胞,发现外泌体可显著抑制细胞增殖。然后分别用RT-qPCR和蛋白芯片分析细胞及培养上清中炎症因子的表达水平。结果表明,外泌体处理组细胞抗炎因子IL-13、IL-6和IL-33的表达水平明显上调(p0.01),而促炎因子IL-1β及TNF-α的表达水平明显下调(p0.01),且细胞培养上清炎症因子的定量蛋白质芯片检测结果与qPCR的结果基本一致。表明外泌体可能抑制宿主细胞的炎症反应。综上所述,本研究首次证明绦虫成虫也可分泌外泌体,并携带大量与其他绦虫蚴类似的蛋白和miRNA。亚洲带绦虫的外泌体被LoVo细胞摄入后,通过其释放的内容物,不仅可以抑制受体细胞的自噬和增殖,而且还可调节炎症因子的表达,从而介导绦虫与上皮细胞间的相互作用,创造适于绦虫生活的肠道微环境。
【图文】：
图 1.1 外泌体的形成(Record et al., 2014b)Fig.1.1 The exosome formation离与鉴定定是外泌体研究的关键。目前，外泌体分离普遍采用的是差结合的方法(Record et al., 2014a; Sheldon et al., 2010)。高速离及其他与 EVs 共沉淀的杂质，即可分离得到微囊泡和外泌更高的外泌体，则应该采用密度梯度离心或免疫磁珠分选的泌体的提纯方法现在主要有超速离心法、PEG 聚合物离心及u et al., 2017)。而外泌体鉴定的标准就是利用透射电子显微TEM）及纳米颗粒示踪法（Nanoparticle tracking analysis, N径大小分析。份种生物活性分子（图1.2），主要成份包括脂质和蛋白质。研份：参与细胞膜运输和融合的蛋白质，，如单体鸟苷三磷酸酶
有多糖分子，通常以大分子糖复合物的形式存在，如糖脂、蛋白聚糖类或翻译后修饰的一些蛋白(Gerlach and Griffin, 2016)。图1.2 外泌体的成份(Wubbolts et al., 2003a)Fig.1.2 The exosomes composition1.2.3 外泌体的功能病原体来源的外泌体可与宿主细胞以不同的方式发生相互作用。外泌体与靶细胞膜融合，可将上述异源性的生物活性物质运输到受体细胞中，并且选择性地改变靶组织的生物学特性(Bucket al., 2014; Mittelbrunn et al., 2011; Montecalvo et al., 2012; Twu et al., 2018)。革兰氏阴性菌来源的外泌体既可与细胞膜直接融合，又可以通过细胞内吞的方式与宿主细胞融合。外泌体可靶向宿主细胞的膜蛋白并激活下游的信号通路，也能传输生物分子到细胞浆中，这为细胞间通讯提供了一种新的机制(Chen et al., 2019)。外泌体在多种生物学过程中发挥作用，尤其是在介导细胞间通讯方面发挥重要功能，参与调控细胞发育与细胞迁移等一系列细胞生命周期活动(Colombo et al.,2014b; Zhang and Grizzle, 2011)。近年来，肿瘤相关外泌体的研究受到越来越多研究者的关注。肿瘤细胞分泌的外泌体及肿瘤微环境中其他细胞分泌的外泌体
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.734
【图文】：
图 1.1 外泌体的形成(Record et al., 2014b)Fig.1.1 The exosome formation离与鉴定定是外泌体研究的关键。目前，外泌体分离普遍采用的是差结合的方法(Record et al., 2014a; Sheldon et al., 2010)。高速离及其他与 EVs 共沉淀的杂质，即可分离得到微囊泡和外泌更高的外泌体，则应该采用密度梯度离心或免疫磁珠分选的泌体的提纯方法现在主要有超速离心法、PEG 聚合物离心及u et al., 2017)。而外泌体鉴定的标准就是利用透射电子显微TEM）及纳米颗粒示踪法（Nanoparticle tracking analysis, N径大小分析。份种生物活性分子（图1.2），主要成份包括脂质和蛋白质。研份：参与细胞膜运输和融合的蛋白质，，如单体鸟苷三磷酸酶
有多糖分子，通常以大分子糖复合物的形式存在，如糖脂、蛋白聚糖类或翻译后修饰的一些蛋白(Gerlach and Griffin, 2016)。图1.2 外泌体的成份(Wubbolts et al., 2003a)Fig.1.2 The exosomes composition1.2.3 外泌体的功能病原体来源的外泌体可与宿主细胞以不同的方式发生相互作用。外泌体与靶细胞膜融合，可将上述异源性的生物活性物质运输到受体细胞中，并且选择性地改变靶组织的生物学特性(Bucket al., 2014; Mittelbrunn et al., 2011; Montecalvo et al., 2012; Twu et al., 2018)。革兰氏阴性菌来源的外泌体既可与细胞膜直接融合，又可以通过细胞内吞的方式与宿主细胞融合。外泌体可靶向宿主细胞的膜蛋白并激活下游的信号通路，也能传输生物分子到细胞浆中，这为细胞间通讯提供了一种新的机制(Chen et al., 2019)。外泌体在多种生物学过程中发挥作用，尤其是在介导细胞间通讯方面发挥重要功能，参与调控细胞发育与细胞迁移等一系列细胞生命周期活动(Colombo et al.,2014b; Zhang and Grizzle, 2011)。近年来，肿瘤相关外泌体的研究受到越来越多研究者的关注。肿瘤细胞分泌的外泌体及肿瘤微环境中其他细胞分泌的外泌体
【学位授予单位】：中国农业科学院
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【学位授予年份】：2019
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本文编号：2599393
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