恶性疟原虫对小分子化合物库（Malaria Box）和双氢青蒿素的筛选及抗药性机制研究

发布时间：2020-03-25 10:01

【摘要】：疟疾是由真球虫目,疟原虫科,疟原虫属的疟原虫是引发的寄生虫病,目前常见感染人类的疟原虫有4种,分别是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum),间日疟原虫(Plasmodium vivax),卵形疟原虫(Plasmodium ovale)和三日疟原虫(Plasmodium malariae)。2017年WHO报道,疟疾仍然在91个国家和地区发生和流行,有2.16亿疟疾感染病例,42.9万人因疟疾而死亡,其中70%的死亡病例为五岁以下儿童。由于没有有效的疟疾疫苗,药物治疗仍是目前防治疟疾的重要手段,但是疟原虫抗药性的出现和传播,导致目前有效的抗疟药物的力不从心,督促着新型抗疟药物的开发和抗药机制的研究。基于上述问题,本研究主要进行了以下两方面的工作。第一部分临床恶性疟原虫株对小分子化合物库的筛选和潜在抗药性分析本实验室前期从中国和缅甸边境病人样本中分离出67株临床恶性疟原虫虫株,使用常用的抗疟药物筛选后,发现8株疟原虫出现了抗药性,体现在半数致死量(IC_(50))增加或虫体生存率的提高。本研究利用这8株临床抗药性恶性疟原虫虫株,对新型抗疟试剂盒Malaria Box中的356种化合物进行了筛选,这些化合物对所有虫株的平均IC_(50)位于7.7~6699.7 nM。进一步选出其中抑制效果较好的前15%共54种化合物,其平均IC_(50)范围是7.7~269.1 nM,这些化合物具有发展成为新型抗疟药物的可能。ChemMine tools分析这54种化合物的化学结构关系,共分为48个组别,显示出化合物构架的多样性,暗示出药物作用途径的丰富性。对比临床虫株与无特定抗药性虫株3D7的IC_(50)差异倍数,定义5倍以上差异为相异化合物表型(DCPs),具有DCPs的化合物意味着在临床疟原虫出现抗药性。本研究结果发现临床虫株对17种化合物敏感性下降,显示了临床虫株对新型抗疟化合物的潜在抗药性。进一步对比已知多种药物抗性虫株Dd2,临床虫株也显示对11种化合物敏感性减弱,说明临床虫株抗药性的多样性。全基因组测序所用恶性疟原虫株,共发现11690单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms,SNPs),将所得的各株的SNPs合成一条假序列,进化分析显现了各虫株间亲缘关系。与已知抗药性Dd2相比,临床虫株在56个基因的SNP与之不同,进一步的统计学分析得到21种基因的SNP与8种化合物敏感性相关。值得关注的有1号染色体的ATP依赖性RNA解旋酶(PF3D7_0103600),14号染色体的plasmepsin I(PF3D7_1407900)和易位子组件PTEX150(PF3D7_1436300)基因位点等。另外定义了48种基因上的113个拷贝数的变异(copy-number variation,CNV),发现了11种基因的CNV与4种化合物敏感性相关。其中值得关注有8号染色体的热休克蛋白70(PF3D7_0818900)和10号染色体的肝阶段抗原-1(PF3D7_1036400)。在本研究中,一方面我们鉴定出Malaria Box中抑虫效果良好的新型化合物,另一方面检测到临床虫株对部分新型抗疟化合物的潜在抗药性,进而对其抗性机制进行研究。本研究不仅对新型抗疟药物的研发和使用具有指导意义,也为抗药性机制提供了新的线索。第二部分体外诱导双氢青蒿素抗药性恶性疟原虫株的抗药性机制研究世界卫生组织推荐青蒿素联合疗法作为治疗疟疾的首选方案。然而在东南亚的一些地区,对青蒿素有抗药性的恶性疟原虫的兴起和传播,严重威胁着全球疟疾的防治。恶性疟原虫抗ART药物机制一直是研究的重要方向,在科学家的不懈努力下,通过实验室筛选或者GWAS分析发现了一些重要抗药性机理,但尚未完全阐明。本研究经过759天双氢青蒿素(DHA)药物体外诱导筛选,获得了抗性较高的恶性疟原虫克隆虫株。抗药性虫株的半数致死量(IC_(50))为母本虫株Dd2的21倍。环状体(RSA)和滋养体(TSA)存活率大幅上升,抗药性虫株可耐受20μM的DHA短时间处理。分析发现TSA与IC_(50)相关性更大,一定程度上解释了经典IC_(50)表型测定方法不适用于鉴定ART类药物抗性的原因。另外,抗药性虫株对其他ART衍生物(青蒿琥酯,蒿甲醚)分别表现出8和10倍的增长,说明了化合物特性结构诱导的抗药性的不同;同时其对氯喹和甲氟喹药物抗药性的增加证实了共同抗药机制的存在。进一步观察DHA抗药性虫株红内期生长方式和生长周期,发现抗性虫株延长了环状体时期,导致整个生长周期增长。全基因组范围内对比分析抗性虫株与母本虫株Dd2的差别,共得到分布于35种基因的190个SNPs。其中一部分结果验证了之前鉴定的抗性位点如pfATG18(PF3D7_1012900),蛋白激酶7(PF3D7_0213400)和保守的疟原虫膜蛋白(PF3D7_1464500)等,证明了这些基因位点的重要性。另一部分新出现的基因位点,如DNA修复和重组蛋白54(PF3D7_0803400),甲酸盐-亚硝酸盐转运蛋白(PF3D7_0316600)和双链断裂修复蛋白(PF3D7_0107800)等,为ART抗药性机制的研究提供了新思路。另外,本研究发现了26个基因CNVs变化,全部为拷贝数增加,值得关注的是九个抗氧化途径的基因;六个线粒体蛋白;两个热休克蛋白;三个离子转运蛋白;泛素蛋白连接酶E3。它们分别在氧化还原、氧化供能途径和泛素化等方面,发挥对抗药物的作用。研究结果为恶性疟原虫抗DHA机制的研究提供了新的线索。恶性疟原虫抗DHA药物机制是一个多分子参与的过程,不可能仅仅通过几个基因位点的SNP或者CNV来完全阐明,本研究进一步完善了恶性疟原虫抗DHA药物的分子机制,为全面揭示抗药性机制打下了基础。
【图文】：

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吉大学博士学位论文红细胞的机制，进行论述。的形成蚊通过叮咬感染疟疾的病人获得了雄性和雌性两tes），随着按蚊肠道内酸碱度（PH）和黄尿酸浓度的改有丝分裂形成八个雄性动合子，在 Pfs48/45 基因调控下进入雌配子母细胞，从而形成受精合子，之后发育为动细胞，在胃基底膜形成球形卵囊，此过程受 DOZI 基因分裂和减数分裂，生成数以万计的子孢子，在卵囊破裂循环集中于按蚊的唾液腺经 10-12 天发育成熟[7, 8]。成熟叮咬人类会再次进去人体。

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巢氏 PCR 流程示意图（Balbir Singh et al, Am. J. Trop. Med. Hyg.Fig. 1.2 Schematic representation of oligonucleotides used in the nepolymerase chain reaction (PCR) assayDNA 探针技术于不同种类的疟原虫，设计出特异性探针，再结合标记的灵敏性的使用，，从而对疟原虫的诊断及虫种的鉴定。在 P. falciparum 检达到了 0.0001％虫血症。虽然 DNA 探针技术具有敏感性和特异存在着操作繁锁、同位素污染等缺点。此法在实际使用中很少见疾疫苗的研究进展于疟原虫复杂生活史和抗原的多样性，这使得疫苗的研制面临着目前科学家在疟原虫各个生活史阶段、多阶段/多抗原疫苗以及全
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.7

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