贝氏隐孢子虫感染雏鸡气管的lncRNA与circRNA的表达谱研究

发布时间：2020-03-25 13:23

【摘要】：贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi)是禽类的优势虫种,主要寄生于宿主的喉头、气管、法氏囊、泄殖腔等部位,可引起呼吸系统疾病,给养禽业带来巨大的经济损失。然而,目前还没有用于C.baileyi的有效预防措施和治疗药物。近年的研究表明,非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)可以参与宿主与病原相互作用过程,调节宿主抗病毒、细菌和寄生原虫的免疫效应,特别是长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)在许多疾病的发生和发展过程中发挥着重要的调节作用,并且还可作为多种疾病诊断和预后的有效生物标志。基于此,本研究以C.baileyi感染雏鸡为模型,首次研究了与C.baileyi感染相关的宿主lncRNA、mRNA和circRNA表达谱。1.成功建立了C.baileyi感染雏鸡模型:雏鸡正常饲养3 d后,经口感染1×10~6 C.baileyi卵囊,结果发现,在感染后5 d至29 d的粪便样品以及感染后2 d到27 d的气管组织样品存在卵囊,序列分析发现这些卵囊均为C.baileyi。排卵囊规律研究显示,排卵囊高峰出现于感染后10 d和16 d,并且以感染后10 d卵囊数量最多。感染后10 d的气管组织经HE染色和电镜观察发现试验组气管中存在卵囊感染,而对照组雏鸡气管组织中未发现虫体。2.获得了C.baileyi感染雏鸡的lncRNA与mRNA的表达谱:取感染C.baileyi 10 d的雏鸡气管,提取RNA,进行lncRNA和mRNA测序,共获得559 574 746个raw reads,过滤掉低质量序列后剩余545 479 934个clean reads。经过筛选,最终获得14 698个mRNA和1376个新的lncRNA,包括1161个基因间非编码RNA(long intergenic non-coding RNA,lincRNA)和215个反义lncRNA(anti-sense lncRNA)。以倍数变化(Fold Change,FC)2.0和q0.05为差异显著标准,在试验组与对照组间共获得差异表达的110个lncRNA(53个上调和57个下调)和948个mRNA(656个上调和292个下调)。随机选择10个mRNA(5个上调和5个下调)和10个lncRNA(5个上调和5个下调)进行qRT-PCR验证,发现qRT-PCR的结果与RNA测序(RNA-seq)的结果一致,从而验证了RNA-seq分析的有效性。此外,本研究利用qRT-PCR方法还检测了部分差异表达基因(6个mRNA和6个lncRNA)在C.baileyi感染后不同时间点(6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d、10 d、16 d、28 d和29 d)的表达水平变化,发现它们在不同时间点均有不同程度的显著变化。靶基因预测显示,在14 418个mRNA和2570个lncRNA之间包含634 780条对应关系,并且一个lncRNA可以调节多个mRNA,一个mRNA也可以对应于多个lncRNA,这些lncRNA可能通过调节IL-4、IL-10、IL-17等细胞因子参与C.baileyi的感染与清除过程。功能富集分析发现,差异的mRNA和lncRNA的靶基因显著富集于Cryptosporidium感染相关的免疫通路。3.获得了C.baileyi感染雏鸡的circRNA表达谱:取C.baileyi感染后10 d试验组和对照组的雏鸡气管组织,进行circRNA测序,共获得9085个circRNA。以FC2.0和p0.05为标准,共筛选出104个差异显著的circRNA,包括65个上调和39个下调的circRNA。利用qRT-PCR方法对随机挑选的6个差异表达的circRNA(3个上调和3个下调)进行验证,其结果与RNA-seq结果的表达趋势相一致。靶基因预测结果显示,在9085个circRNA和978个miRNA之间存在相互作用关系。功能分析结果表明,差异circRNA的来源基因主要富集于一些代谢通路。另外,qRT-PCR分析发现差异表达的4个circRNA(2个上调和2个下调)在C.baileyi感染的整个过程中均有显著变化,提示它们可能参与宿主与病原之间的相互作用。综上所述,本研究首次运用高通量测序技术对雏鸡感染C.baileyi后的mRNA、lncRNA和circRNA表达谱进行了分析,共获得差异表达的948个mRNA、110个lncRNA和104个circRNA,这些RNA可能通过调控相关靶基因的表达在C.baileyi和宿主互作中发挥关键作用。此外,这些预测的mRNA、lncRNA和circRNA的相关信号通路将可用于充分揭示C.baileyi感染的发病机制。
【图文】：

卵囊,气管,雏鸡,醋酸异戊酯

镜样品制备与观察感染后 10 d 剖杀雏鸡，取其气管组织，切成 2 mm3大小的方理盐水冲洗，戊二醛溶液固定 24 h 以上，取出修成 1 mm3大S 多次冲洗（每次大约 10 min）；锇酸再固定 2 h，PBS 冲洗几次；经过 30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮（3 次）脱水（每入醋酸异戊酯中置换，于二氧化碳临界点干燥、喷金，用扫检查结果蔗糖漂浮法处理试验组雏鸡粪便样品（图 2-1A）以及用胰（图 2-1B），均在显微镜下检出了 C. baileyi 卵囊，可看到为粉红色的椭圆形，，卵囊内隐约可见的部分黑色实心结构为

贝氏隐孢子虫,卵囊,雏鸡,感染后

A 标准 DL 2000；1，9，19，31，49，59. 阴性对照；2. 感染前组织样品；3～7，1，40～47，54～57，66～71. 感染后 0~31 d 试验组组织样品；10～13，20～24，32～353，60～65. 对照组组织样品；8，18，30，48，58，72. 阳性对照A Marker DL 2000; 1, 9, 19, 31, 49, 59. Negative control; 2. Pre-infected tissue samples; 3-, 40-47, 54-57, 66-71. Tissue samples of the experimental group 0 to 31 d pi; 10-13, 20-24,50-53, 60-65. Tissue samples of the control group; 8, 18, 30, 48, 58, 72. Positive control图 2-4 气管组织样品 PCR 扩增结果Fig. 2-4 The PCR amplication of tracheal tissue samples排卵囊规律鸡感染 C. baileyi 卵囊后收集粪便样品，用血细胞计数板计算其 OPG 值，律。发现雏鸡于感染后 5 d 开始排卵囊，在 10 d pi 和 16 d pi 各出现一个并且 10 d pi 的卵囊数量最多，感染后 29 d 排卵囊结束（图 2-5）。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.31

【参考文献】