旋毛虫三种半胱氨酸蛋白酶抑制因子的功能研究及重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

发布时间：2020-03-25 18:00

【摘要】：由于旋毛虫的传播途径复杂,宿主地理分布广泛,旋毛虫病仍未得到有效控制。加强对该病的诊断和通过有效的疫苗阻断旋毛虫的传播是预防人类或者家养动物感染旋毛虫病的有效手段。寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine protease inhibitor,CPI或cystatin)不仅具有独特的半胱氨酸蛋白酶抑制活性,而且还可以调节宿主免疫反应,在寄生虫逃避宿主免疫应答,适应寄生生活中起着重要作用。本研究成功克隆了旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2基因,并且在原核表达系统中诱导表达,纯化后的重组蛋白具有蛋白酶抑制活性,可以在不同pH和温度下抑制人组织蛋白酶B的活性。TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2在旋毛虫的肌幼虫、成虫和新生幼虫时期均有转录,主要表达于肌幼虫的表皮和杆状体中。体外研究了重组TsCystatins对IFN-γ激活的巨噬细胞RAW264.7的影响。结果发现,重组TsCystatins和IFN-γ共同作用于RAW264.7细胞明显抑制了NO的产生,并且呈现剂量依赖性。重组TsCystatins能够抑制IFN-γ激活的RAW264.7细胞促炎性细胞因子(IL-6、IL-12和TNF-α)的分泌,而重组TsCystatins单独作用促进了抗炎性细胞因子(IL-10)的分泌。说明TsCystatins是旋毛虫感染宿主的免疫调节分子,通过抑制宿主巨噬细胞的炎症反应逃避宿主的免疫应答,来达到在宿主体内长期寄生的目的。攻击感染试验结果发现,重组的TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2能够刺激机体产生较高水平的抗体,但是不能有效的减少免疫鼠肌肉中旋毛虫的荷虫量。为了进一步确定TsCystatins对旋毛虫感染的免疫保护力,我们以弓形虫弱毒株RHΔGRA17为表达载体,使得TsCystatin2成功表达,且对该弱毒株的体外裂殖、宿主细胞的入侵及在宿主细胞内的增殖不产生影响。小鼠免疫RHΔGRA17::TsCystatin2产生较高水平的抗弓形虫特异性IgG;利用弓形虫裂解抗原刺激免疫之后的脾细胞能够产生较高水平的IL-12及IFN-γ。腹腔感染弓形虫强毒株试验的结果发现,小鼠免疫RHΔGRA17::TsCystatin2能抵抗弓形虫的再次感染。另外,免疫转基因RHΔGRA17::TsCystatin2虫株能够刺激小鼠产生抗旋毛虫特异性的体液免疫应答以及Th1为主的细胞免疫应答(较高水平的IgG2a、IL-12和IFN-γ)。但是,Th2型细胞因子(IL-4和IL-10)在免疫小鼠中并没有显著增加,而这种Th1主导的免疫反应并不能使免疫小鼠在随后的旋毛虫攻击感染中获得有效的免疫,即不能有效的减少免疫鼠肌肉中旋毛虫的荷虫量。以上研究结果说明TsCystatins可能不是理想的疫苗候选蛋白。此外,本研究以旋毛虫属(Trichinella spp.)线粒体小亚单位核糖体RNA(rrnS)基因为靶点,建立了重组酶聚合酶扩增技术和侧流层析试纸条(LF-RPA)联合检测旋毛虫感染的诊断方法。该方法可在25-45℃范围内进行,10-25 min内即可完成,且可检测到低至100 fg的旋毛虫DNA,具有简便、快速、准确、高特异性和敏感性的特点。
【图文】：

序列,结构特征,旋毛虫

随后 Tang（Tang et al., 2015）也证明了此蛋白具有较好的抗原性，可以作为旋毛虫诊断或疫苗的候选抗原。另外，旋毛虫 cystatin 样蛋白可以引起宿主 Th1 和 Th2 混合免疫应答，降低 STAT6 的转录，，抵御宿主的快速排虫（Liu et al., 2014）。本实验室采用电子克隆的方法从 GenBank EST 数据库获得旋毛虫 cystatin 基因家族的部分 cDNA 序列，根据此序列设计引物进行 RT-PCR，克隆得到旋毛虫 cystatin 基因家族 3 个成员的完整开放阅读框，分别命名为 TsCystatin1、TsCystatin2 和TsStefin（付宝权，2012）。对其序列的初步分析表明（图 1.1），获得的 TsStefin 全长 294 bp，编码 97 个氨基酸，不含信号肽序列。获得的 TsCystatin1 全长 666 bp，含有 75 bp 的信号肽序列，编码 221 个氨基酸。获得的 TsCystatin2 全长 423bp，含有 48bp 的信号肽序列，编码 140 个氨基酸。对其结构分析发现，TsStefin 属于 1 型 cysttins，TsCystatin1 和 TsCystatin2 属于 2 型 cystatins，与其他线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子相似，三个基因都具有半胱氨酸蛋白酶抑制因子的结构特点，保守的 Gly 残基及 QXVXG 基序。TsCystatin1 和 TsCystatin2 编码蛋白在 C 末端有两个二硫键（其它已知线虫只有一个二硫键），TsStefin 编码蛋白 C 末端没有二硫键，但是有一个潜在的 N-糖基化位点（stefin 家族一般都不是糖蛋白）。对其功能研究的初步实验结果表明，TsCystatin1、TsCystatin2 和 TsStefin 对组织蛋白酶 L 均具有一定的抑制作用，说明本实验室鉴定的三个旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子均具有蛋白酶抑制活性。但是旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子是否具有类似其他寄生性线虫对宿主的免疫调节作用是我们深入研究此蛋白功能的重点。

原理图,原理,炎症反应,宿主

图 1.2 RPA 扩增反应的原理（引自 Li et al., 2018）Fig. 1.2 RPAreaction mechanism命周期的过程中要不可避免地与宿主组织进行亲密接给宿主的免疫系统。在长期与宿主免疫系统接触的过程多种机制以使蠕虫能够在宿主体内存活。寄生虫 cysta以调节免疫应答非相关的炎症反应。如 Av-cystatin 在两炎症反应。在气道高反应性小鼠模型中，过敏原致敏过了几种疾病参数的显著降低。Av-cystatin 显著降低了肺部支气管粘液的产生。这些作用主要依赖于巨噬细胞和除巨噬细胞后这种影响消失（Schnoeller et al., 2008）。过度的Th2型炎症反应抑制梯牧草花粉引起的过敏反应（睾吸虫的 Ⅰ 型半胱氨酸蛋白酶抑制剂为实验材料，建立现炎症和肠损伤明显减轻，这与 IL-10 升高引起巨噬虫能够在人体内存活多年，其半胱氨酸蛋白酶抑制因子
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.7

【相似文献】